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乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)引起,危及全球人类健康的传染病。在HBV感染过程中,适应性免疫应答在肝脏损害及病毒清除中发挥重要作用。研究表明,急性HBV感染时,激活外周血CD4+辅助性T细胞及CD8+细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T-lymphocyte response,CTL)反应能够有效清除病毒。慢性HBV感染时,抑制性受体在病毒特异性CD8+T细胞表达逐渐增多,参与了CD8+T细胞耗竭,使其无法发挥有效清除病毒作用,导致病毒持续存在和肝损伤。阻断抑制性受体通路可逆转T细胞耗竭,增强T细胞免疫,从而增强病毒清除能力。T细胞免疫球蛋白域和免疫受体酪氨酸抑制基序(T cell immunoglobulin and immune receptor tyrosine-based inhibitory motif domain,TIGIT)是在基因组研究中发现的共抑制受体,主要表达于T细胞、自然杀伤性细胞(Natural killer,NK)和调节性T细胞(Regulated T cell,Treg)等细胞表面。在病毒感染免疫方面,TIGIT在淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(Lymphocytic choriomeningitis virus,LCMV)、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)和人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)等感染的T细胞免疫中作为共抑制受体起关键作用。TIGIT作为抑制性受体在乙肝病毒感染中作用的相关研究少。近期有研究报道,在HBs Ag阳性小鼠中,TIGIT作用于肝脏HBV特异性CTL导致细胞免疫耐受,HBV难以清除,阻断TIGIT通路或抑制TIGIT表达可使HBV特异性CTL功能恢复,导致肝脏炎症激活和乙肝病毒清除。程序性死亡受体-1(programmed cell death protein 1,PD-1)也是参与T细胞耗竭的一个关键负调控分子。TIGIT作为抑制性受体在慢性HBV感染者T细胞中的表达和功能及其与PD-1是否有协同作用尚无相关报道。本研究主要探讨TIGIT在慢性HBV感染者T细胞中的表达和功能,并揭示TIGIT与PD-1在慢性HBV感染者T细胞功能耗竭中的协同作用。本研究分为以下三个部分:第一部分TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞表达的研究目的:研究TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞、T细胞分化亚群和HBV特异性CTL上的表达及其与PD-1表达的关系。方法:收集和分离73例慢性HBV感染者和28例健康志愿者(healthy donors,HD)血浆和外周血单个核细胞(PBMC)并冻存。采用流式细胞术检测:(1)TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者组和HD组CD4+和CD8+T细胞表达;(2)TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者组和HD组CD4+和CD8+T细胞不同分化阶段的表达;(3)采用人白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-A*0201/FLPSDFFPSV(HBVcore18-27)和HLA-A*0201/NLVPMVATV(cytomegalovirus 65 k Da Phosphoprotein,CMVpp65)五聚体(pentamer,PENTA)检测HBV和CMV特异性CTL,随后检测TIGIT和PD-1在HBV及对照CMVpp65特异性CTL表达。结果:(1)与HD组相比,TIGIT在慢性HBV感染者PBMC中的CD4+和CD8+T细胞表达明显升高(12.28±0.93%vs.7.98±0.86%,P=0.0083;30.77±2.00%vs.16.61±2.17%,P=0.0001);(2)与乙肝病毒e抗原(Hepatitis B e Antigen,HBe Ag)阴性组相比,TIGIT在HBe Ag阳性慢性HBV感染者组CD4+和CD8+T细胞表达明显升高(13.79±1.31%vs.10.19±1.17%,P=0.0130;32.94±2.84%vs.27.75±2.64%,P=0.0043);(3)与HD组相比,TIGIT在慢性HBV感染者各T细胞分化亚群表达均上调(P值均<0.05);且TIGIT在慢性HBV感染者CD28-CD45RA+CD4+和CD28-CD45RA+CD8+T细胞表达最高(P<0.01,P<0.001);(4)TIGIT在慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞上的表达和PD-1的表达呈正相关。TIGIT和PD-1在CD4+T细胞及CD8+T细胞表面均存在双阳性表达;(5)与CMVpp65特异性CTL相比,TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者HBVcore18-27特异性CTL表达明显升高(P<0.0001,P=0.0003);(6)与PENTA-CD8+T细胞相比,TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者HBVcore18-27特异性CTL表达明显升高(P<0.0001,P<0.0001);(7)TIGIT和PD-1在HBVcore18-27特异性CTL上双阳性表达所占百分比与TIGIT单阳性及PD-1单阳性表达所占百分比相比有差异(P<0.001),以双阳性表达所占百分比最高。结论:(1)TIGIT在慢性HBV感染者PBMC中的CD4+和CD8+T细胞表达均上调,在效应性T细胞亚群的表达最高;TIGIT在HBe Ag阳性慢性HBV感染者PBMC中的T细胞表达高于HBe Ag阴性者;(2)TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞上存在共表达状态;(3)TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者HBV特异性CTL高表达,且以TIGIT和PD-1共表达状态为主。第二部分TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞中的功能研究目的:研究TIGIT对慢性HBV感染者CD8+T细胞细胞因子分泌、细胞增殖及凋亡敏感性的影响及TIGIT和PD-1的协同作用。方法:收集和分离85例慢性HBV感染者血浆和PBMC并冻存。采用流式细胞仪检测:(1)用佛波酯/离子霉素(phorbol 12-myristate-13-acetate/ionomycin,PMA/ionomycin)刺激,表面染色法检测TIGIT+和TIGIT-CD8+T细胞群表达CD69;采用胞内染色法检测TIGIT+和TIGIT-CD8+T细胞群分泌颗粒酶B(Granzyme B,Gr B)和穿孔素(Perforin);(2)用HBVcore18-27肽段刺激,检测:(1)TIGIT阳性和TIGIT阴性HBV特异性CTL群表达CD69,TIGIT阳性和TIGIT阴性HBV特异性CTL群分泌Gr B、Perforin、干扰素-γ(interferon-gamma,IFN-γ)、白介素-2(Interleukin-2,IL-2)和肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α);(2)采用羟基荧光素二酯酸盐琥珀酰亚胺脂(carboxy-fluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)实验检测细胞增殖;(3)TIGIT+和TIGIT-CD8+T细胞在未处理组、活化诱导凋亡(activation induced cell death,AICD)组和阻断TIGIT通路组凋亡比例;(4)用PMA/Ionomycin刺激,检测TIGIT+PD-1+和TIGIT-PD-1-CD8+T细胞分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α;(5)阻断TIGIT和/或PD-1通路,用HBVcore18-27肽段刺激,检测HBV特异性CTL分泌IFN-γ和IL-2。结果:(1)与TIGIT-CD8+T细胞群相比,TIGIT+CD8+T细胞群表面活化标记CD69表达明显升高(P=0.0095),TIGIT+CD8+T细胞群中分泌Gr B和Perforin的细胞所占百分比明显下降(P=0.0205,P=0.0377);(2)与TIGIT阴性HBV特异性CTL群相比,慢性HBV感染者TIGIT阳性HBV特异性CTL群表达CD69明显升高(P=0.0014),TIGIT阳性HBV特异性CTL群中能够分泌Perforin和Gr B的细胞所占百分比明显下降(P=0.0360,P=0.0205);(3)与TIGIT阴性CTL群相比,慢性HBV感染者TIGIT阳性HBV特异性CTL群中能够分泌IFN-γ、IL-2和TNF-α的细胞所占百分比均下调(P=0.0407,P=0.0446,P=0.0087),细胞增殖降低(P=0.0029);阻断TIGIT通路并用HBVcore18-27肽段刺激,HBV特异性CTL增殖增加(P=0.0023);(4)与未活化诱导组相比,活化诱导后CD8+T细胞群凋亡敏感性增强(P=0.0004);与活化诱导后TIGIT-CD8+T细胞组相比,活化诱导后TIGIT+CD8+T细胞群凋亡敏感性增强(P=0.0070);阻断TIGIT通路,CD8+T细胞凋亡敏感性下降(P=0.0003);(5)与TIGIT-PD-1-CD8+T细胞相比,慢性HBV感染者TIGIT+PD-1+CD8+T细胞分泌IFN-γ(P<0.001)、IL-2(P<0.001)、TNF-α(P<0.001)所占百分比明显下调;与对照组相比,阻断TIGIT和/或PD-1通路慢性HBV感染者HBV特异性CTL中分泌IFN-γ和IL-2的细胞所占百分比明显增多(P<0.001,P<0.001);与单独阻断TIGIT通路相比,联合阻断TIGIT和PD-1通路组慢性HBV感染者HBV特异性CTL中分泌IFN-γ和IL-2的细胞所占百分比明显增多(P<0.001,P<0.001)。结论:(1)表达TIGIT的慢性HBV感染者PBMC中CD8+T细胞和HBV特异性CTL活性增加,其释放效应分子功能受到抑制;(2)TIGIT参与抑制慢性HBV感染者CD8+T细胞细胞因子分泌和细胞增殖,使其细胞凋亡敏感性增加;(3)阻断TIGIT通路,慢性HBV感染者HBV特异性CTL分泌细胞因子上调,细胞增殖功能增强,CD8+T细胞凋亡敏感性降低;(4)阻断TIGIT和PD-1通路可逆转耗竭的HBV特异性CTL细胞因子分泌功能。第三部分TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞表达与临床指标相关性研究目的:研究TIGIT在慢性HBV感染者外周血T细胞和HBVcore18-27特异性CTL表达与临床指标的相关性。方法:收集和分离141例慢性HBV感染者和20例HD外周血血浆和PBMC并冻存。用如下方法检测:(1)全自动生化仪检测谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)和转肽酶(gamma-glutamyl transpeptidase,GGT)等指标;(2)化学发光法检测乙肝病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen,HBs Ag)、HBe Ag滴度等;(3)实时荧光定量聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)检测HBVDNA载量;(4)采用流式细胞术检测:(1)TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞表达;(2)TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者HBVcore18-27特异性CTL表达;(3)TIGIT在慢性乙型肝炎组、乙肝相关肝硬化组和乙肝肝硬化合并原发性肝癌组和健康者组外周血CD4+和CD8+T细胞表达;(4)TIGIT在接受拉米夫定(lamivudine,LAM)、阿德福韦酯(adefovir dipivoxil,ADV)、替比夫定(Telbivudine,LDT)和恩替卡韦(entecavir,ETV)抗病毒治疗和未接受抗病毒治疗慢性HBV感染者外周血CD4+和CD8+T细胞表达。结果:(1)TIGIT在CD4+和CD8+T细胞表达分别与ALT水平和HBVDNA载量对数值呈正相关;(2)TIGIT在HBVcore18-27特异性CTL表达分别与ALT水平和HBVDNA载量对数值呈正相关;PD-1在HBVcore18-27特异性CTL表达分别与ALT水平和HBVDNA载量对数值呈正相关;(3)TIGIT和PD-1在CD4+和CD8+T细胞共表达分别与ALT水平和HBVDNA载量对数值呈正相关;(4)与未接受抗病毒治疗组相比,TIGIT在接受四种核苷(酸)类似物治疗的慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞表达均下调,有明显统计学差异(P<0.001,P<0.001),且在ETV组表达最低;(5)随着慢性HBV感染病程进展,TIGIT在慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞表达呈上升趋势(P<0.001,P<0.001),且TIGIT和PD-1在慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞共表达亦呈上升趋势(P<0.001,P<0.001)。结论:(1)在慢性HBV感染者中,乙肝病毒复制和肝脏炎症环境可能诱导TIGIT和PD-1在T细胞和HBVcore18-27特异性CTL表达上调,并随着病情进展TIGIT和PD-1在T细胞的共表达呈上升趋势;(2)四种核苷(酸)类似物抗病毒药物均可抑制TIGIT在慢性HBV感染者CD4+和CD8+T细胞表达。