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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)能够引起以多发性纤维素性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征性临床症状的副猪嗜血杆菌病(又称猪革拉瑟氏病)。自然转化(Natural transformation)是细菌在自然条件下,主动摄取外源DNA并将其整合到自己的染色体中并稳定遗传的过程。副猪嗜血杆菌自然转化的试验方法是一种基因操作系统,常用以研究毒力相关基因的功能。本研究对现用的自然转化方法的操作细节进行优化,以提高通过自然转化构建缺失株的转化效率,并筛选具有自然转化能力的田间分离株,以利于后续HPS相关研究工作的开展。细菌com系列基因与细菌的自然转化能力有一定的联系,ComA蛋白在不同自然感受态细菌自然转化过程中发挥着不同的作用,本研究以副猪嗜血杆菌ComA蛋白为研究对象,通过构建comA基因失活株和comA基因互补株,研究其在HPS不同生物学特性中所发挥的作用。1.自转化条件的优化与评价采用控制变量法,使用本实验室构建保存的重组质粒及已证明为自然感受态的M-3菌株,对HPS自然转化操作方法的不同环节进行优化,其中包括:细菌点样时的生长阶段,平板点样孵化的时间,转化体系细菌、外源cAMP、外源质粒的浓度以及转化后平板孵化的时间。计算不同条件所对应的自然转化频率,,探索HPS自然转化最优条件:当细菌处于对数生长后期(OD600≈1.5～1.7)时点样孵化13h;转化体系细菌浓度控制在0.2≤1/100OD600≤0.4;体系中外源质粒的浓度应大于0.1μg/μL;转化后平板孵育5h。2.自然感受态的筛选使用经优化的自然转化实验方法分别对实验室鉴定保存的HPS 15株标准血清型参考菌株和75株田间分离株进行自然感受态的筛选,其中15株标准血清型参考菌株未检测到自然转化的发生,而75株田间分离株中,有11株被确定为自然感受态,其中三株具有较高的自然转化能力。3.重组自杀质粒及回补质粒的构建根据SC1401全基因组序列设计引物克隆comA基因内部同源片段及Kan抗性盒,通过融合PCR将抗性盒连接到基因下游,并将得到的片段连接到pK18mobsacB质粒载体中,得到重组质粒RLcomA-Kan-pK18;根据全基因组序列设计引物克隆包含启动子在内的comA基因全序列,将其连接到pMC-express穿梭表达质粒载体中,得到重组质粒pMC-comA。4.SC1401菌株comA基因失活株及互补株的构建将重组质粒RLcomA-Kan-pK18通过自然转化的方法转化入SC1401菌株,通过筛选得到SC1401菌株comA基因失活株comA::Kan～SC1401;将重组质粒pMC-comA电转化至大肠杆菌S17(λ),得到pMC-comA～S17(λ),使用菌株pMC-comA～S17(λ)、comA基因插入失活株comA::Kan～SC1401,采用接合转移的方法,构建comA基因互补株CcomA～SC1401。comA基因失活株、互补株经PCR、RT-PCR以及Western blotting鉴定,证明其构建的准确性。5.ComA功能的初步研究通过测定SC1401亲本株、comA基因失活株及互补株生长曲线,表明comA的失活对SC1401的生长趋势有一定的影响。光学显微镜下细菌形态的观察表明了com 基因对SC1401形态有明显的影响:亲本株呈短杆至长杆的多形性;缺失株呈短杆甚至球形;互补株恢复多形性,但以短杆状为主。透射电镜观察到comA失活株的胞质内出现一些低电子密度的“空白”区。温度压力及pH压力试验结果表明,comA基因的失活使菌株对酸的耐受性降低,但影响不显著(p>0.05);对SC1401碱及高温的耐受性无明显变化。血清抗性试验表明comA基因失活后SC1401抗血清杀伤能力有一定提高(p<0.05)。自凝集试验结果表明comA基因的失活,使菌株自凝集速度显著加快。生物被膜形成试验结果表明comA的失活使亲本株生物被膜形成能力显著降低(p<0.05)。比较亲本株、comA失活株及互补株的自然转化能力,表明comA在HPS自然转化过程中发挥着较重要的作用(p<0.05)。综上,本研究分析了 HPS自然转化方法不同条件对转化发生频率的影响,通过优化操作条件,显著提高了 HPS自然转化发生频率,增加阳性转化子筛选概率。对实验室分离鉴定的田间分离株进行自然感受态的筛选,共得到11株自然感受态菌株。通过构建SC1401菌株的comA基因失活株及互补株,初步验证了 ComA在HPS细菌形态、自凝集活性、生物被膜形成能力及自然转化等方面的作用,为进一步探索ComA在HPS中的作用奠定了基础。