论文部分内容阅读
菊花(Chrysanthemum morifolium)是我国传统名花,也是世界四大切花之一,其产量和销量均位于世界花卉前列。本研究以目前国内外市场销量最大的切花菊品种‘神马’[Chrysanthemummorflorium(Ramat.) Kitam.‘Jinba’]为材料,利用cDNA-AFLP技术,对不同光周期处理的菊花茎尖基因表达图谱进行分析,分离并鉴定差异表达的基因,通过克隆测序,BLAST分析,获得了6个可能与开花相关的基因片段,为从分子水平上了解菊花花芽分化的分子机理,通过基因工程技术培育不同目标花期的菊花新品种奠定基础。主要研究成果如下:1、建立了适合菊花的cDNA-AFLP分析体系TRNzol法提取的RNA较完整,纯度较高;采用Oligo(dT)18Primer及经过改造和优化的BeyoRT M-MuLV反转录酶得到ds cDNA,将1μg的cDNA利用EcoR Ⅰ/MseⅠ快速双酶切5min,连接产物稀释10倍作为预扩增反应的模板,扩增30个循环,其检测结果较理想;预扩增产物稀释50倍作为模板,采用Touchdown程序,选用64对AFLP引物进行选择性扩增;扩增产物经6%的PAGE电泳后采用改进的快速银染体系,得到了清晰可辨的cDNA-AFLP凝胶图谱。本研究建立的反应体系适用于菊花功能基因的cDNA-AFLP研究。2、利用所建立的cDNA-AFLP技术体系,筛选菊花开花相关基因64对引物组合检测到2917个cDNA片段,获得差异表达的TDF共835个,其中584个为上调表达,251个为下调表达。对克隆测序成功的50个差异表达TDF进行分析,结果表明,36个TDF可以在NCBI数据库中找到同源序列。其中31个TDF为已知功能的基因(dbEST登录号:JG700127-JG700157),5个TDF未找到同源序列。按照其功能分类,将31个差异表达基因分为7类:信号转导、分化发育、转录调控、蛋白质代谢、能量与代谢、抗病与防御等相关基因、未知或假定蛋白基因及未知基因。3、6个与开花相关的TDF的RT-PCR验证对选取的6个与开花相关的TDF进行半定量RT-PCR验证,结果表明,6个基因片段在短日照条件下均特异表达或表达上调,而在长日照下均未见表达或表达下调,这与cDNA-AFLP表达谱结果相一致。本研究利用cDNA-AFLP技术筛选了菊花花芽分化期多个与菊花开花相关的基因片段,这些基因片段将进一步用于功能鉴定和转基因利用。