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鸡贫血病毒(Chicken anemia virus,CAV)是危害养鸡业的重要免疫抑制病病原之一,该病毒基因共编码VP1、VP2和VP3三个蛋白,每个蛋白在其感染过程中作用不同,且相互关联。本研究在课题组前期分离、鉴定CAV临床毒株及构建了病毒感染性克隆pcDNA-2CAV的基础上,对病毒的三个蛋白重要功能区的部分氨基酸进行定点突变,构建含点突变CAV基因的重组质粒进行体内和体外实验,并进行病毒拯救。(一)构建双拷贝CAV突变体感染性克隆参考本实验室分离的CAV基因序列,运用Megaprimer PCR突变方法分别对病毒VP1第394位氨基酸(决定病毒致病性氨基酸谷氨酰胺)、VP2第101位氨基酸(磷酸化基序中精氨酸)、VP3起始位点氨基酸(甲硫氨酸)和VP3第85位氨基酸(核定位信号内丝氨酸)进行定点突变。通过设计定点突变引物扩增出含点突变的全基因组序列,分别连接到pEASY-Blunt Zero载体上,转化大肠杆菌DH5α,利用载体携带的自杀基因和菌液PCR筛选阳性克隆,并送往生物公司测序;将含有正确突变的重组质粒,经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切并胶回收纯化目的片段,与真核表达载体pcD NA3.1(+)连接。再通过PCR获得两端含KpnⅠ酶切位点的CAV全基因组,与KpnⅠ单酶切的单拷贝感染性克隆突变体顺次连接、转化并鉴定。结果显示,本实验成功构建出双拷贝CAV突变体克隆,根据点突变的位置及功能不同将构建的突变体克隆分别命名为pcDNA-2CAV-VP1Q394、pcDNA-2CAV-VP2R101、pcDNA-2CAV△VP3和pcDNA-2CAV-VP3S85。(二)CAV突变病毒的拯救首先利用SPF鸡胚检测上述构建的突变重组质粒对于机体组织的侵染性。将7日龄SPF鸡胚随机分组,经卵黄囊接种不同突变重组质粒和对照样品,每组3个重复,将鸡胚继续孵化至第19天进行剖检,观察病变并采集胸腺等组织应用PCR方法分析病毒特异性基因。结果显示,仅有接种pcDNA-2CAV-VP1Q394实验组鸡胚腿肌有出血。病毒特异性基因检测发现实验组的突变CAV基因存在于SPF鸡胚组织内,说明这些突变重组质粒侵染鸡胚后可能复制增殖病毒。为了获得在MSB1细胞系上具有增殖能力的感染性突变体,将上述构建的四种质粒通过脂质体3000转染MSB1细胞,进行病毒拯救。通过荧光染色观察第5代细胞凋亡情况,并以PCR和Western blotting方法分别检测病毒基因和蛋白在细胞内表达情况。结果显示,在细胞传代过程中除了VP3缺失实验组外都能检测到突变病毒基因,不同突变组发生凋亡情况存在差异,且在侵染后除VP3缺失突变组外均能检测到病毒相关蛋白的表达。以上结果证明,成功构建了CAV突变体感染性克隆,这些突变体克隆能够对MSB1细胞产生不同侵染效应。将拯救得到的病毒侵染正常细胞,并将细胞进行传代,通过标签检测发现只有pcDNA-2CAV-VP1Q394拯救病毒侵染组存在突变病毒,且将此拯救病毒命名为CAVVP1Q394。综上所述,本研究对CAV的VP1、VP2和VP3蛋白的氨基酸重要调控位点进行了定点突变,构建了4种双拷贝CAV突变体克隆,并通过接种细胞和鸡胚分析突变体的侵染性,最终拯救出CAVVP1Q394突变病毒,并初步观察了其对细胞的病变能力,这些结果为进一步探讨CAV致病机制奠定基础并为研究新型基因疫苗候选株提供参考。