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肝纤维化是各种致病因素作用于肝脏，导致细胞外基质(ECM)在肝脏内过量沉积的损伤修复过程，活化的肝星状细胞(HSC)是产生ECM的主要来源细胞。文献报道甲基化CpG结合蛋白2(MeCP2)在HSC活化增殖过程中起促进作用。进一步研究MeCP2在肝纤维化形成中的分子机制，使用小干扰RNA技术和5-杂氮-2-脱氧胞苷(5-AzadC)，探讨对HSC细胞活化增殖的影响，有利于发现潜在治疗HSC细胞活化增殖的新靶点。本实验拟以TGF-β1刺激诱导HSC活化，重点观察Hedgehog(Hh)信号转导通路在HSC活化增殖中的作用，及MeCP2对Hedgehog(Hh)信号转导通路的影响。研究内容主要包括以下三个部分：1.大鼠肝纤维化组织中Shh、PTCH1、Gli1的表达变化大鼠皮下注射CCl4制备SD大鼠肝纤维化模型，CCl4处理组(12W)和正常组各20只。自造模开始，给予CCl4花生油(体积比1:1)1ml/kg剂量皮下注射模型组SD大鼠，2次/周，总计12W；给予正常组皮下注射1ml/kg剂量花生油。制备模型完毕，取出肝脏组织用于Masson胶原染色和HE染色检测，观察大鼠肝组织中Shh、PTCH1、Gli1的表达情况，同时，检测在TGF-β1体外刺激诱导活化HSC过程中Shh、PTCH1、Gli1的表达情况。研究发现，CCl4成功诱导肝纤维化疾病模型，PTCH1的表达在肝纤维化模型中显著减少，Shh、Gli1的表达逐渐增高。2. DNA甲基化抑制剂和MeCP2对肝星状细胞活化增殖的影响利用DNA甲基化抑制剂5-AzadC和RNA干扰沉默MeCP2以观察对HSC-T6细胞增殖的影响。HSC-T6体外培养，应用5ng/ml TGF-β1刺激细胞24h后，然后加入5-AzadC孵育48h，MTT实验观察5-AzadC对肝星状细胞增殖活性的影响，流式细胞术检测HSC-T6细胞周期的变化，QRT-PCR实验检测Col1A1、α-SMA的mRNA表达变化；另外，借助免疫组化和QRT-PCR实验观察MeCP2、α-SMA在肝纤维化模型中的表达情况。依照小RNA设计原则合成MeCP2的小干扰RNA(RNAi)，借助LipofectamineTM2000脂质体瞬时转染进入HSC-T6细胞里，流式细胞术检测HSC-T6细胞周期的变化。检测结果发现：应用5-AzadC处理HSC-T6后α-SMA、CollagenⅠ的表达水平明显降低；提示靶向沉默MeCP2表达和5-AzadC处理后，能够有效抑制HSC-T6的活化增殖。以上结果表明，MeCP2和DNA甲基化在肝纤维化形成和HSC活化过程中发挥了重要作用。3. MeCP2对PTCH1表达的调控机制研究前期研究发现，应用DNA甲基化特异性抑制剂5-AzadC处理HSC可明显抑制其活化增殖，并可促进PTCH1在活化的HSC中的表达。提示在HSC活化过程中DNA甲基化参与调控PTCH1的表达。据此推测，PTCH1表达下降可能与PTCH1启动子区域发生甲基化有关。文献报道，MeCP2作为DNA甲基化重要的结合蛋白参与调控HSC活化增殖。利用小干扰RNA沉默MeCP2表达后，可明显提高PTCH1的表达水平，提示MeCP2与PTCH1表达沉默密切相关。这些实验结果进一步提示，PTCH1表达下降与PTCH1启动子区域甲基化有关，为临床防治肝纤维化的潜在治疗作用靶点。