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目的:通过对市场上调研的枸杞子提取的研究,后采用正交设计法优化提取枸杞子中的功效成分,制备枸杞子提取物,并建立了枸杞子提取物中的功效成分枸杞多糖、总黄酮和甜菜碱的含量测定方法,并进一步对枸杞子提取物的质量标准进行全面研究,制定其质量标准草案,为进一步控制市场上枸杞子提取物的质量,更加科学的保障其安全、有效、合理使用奠定基础。
方法:
1.制备枸杞子提取物的正交设计实验:采用回流提取法,以含醇量、固液比、提取时间、提取次数为影响因素,以提取率和总黄酮为考察指标通过L9(34)正交试验优选提取工艺。
2.枸杞子提取物中总黄酮和枸杞多糖的含量测定:采用紫外-可见分光光度法对其进行测定。
3.枸杞子提取物中甜菜碱的LC-MS-MS的含量测定方法的建立:以氨基柱为分离色谱柱,柱温为35℃,电喷雾离子源(ESI)为离子源,对其流动相离子化模式,扫描方式,干燥气温度,雾化器压力,干燥气流速,毛细管电压进行优化。
4.建立枸杞子提取物质量标准草案以及相关起草说明:采用薄层色谱法鉴别枸杞子提取物,以枸杞多糖、总黄酮、甜菜碱含量作为质量控制的指标,因枸杞子提取物常用于保健食品原料,故参照食品中重金属、农药残留、微生物检查标准对其安全性指标加于控制。
5.以高、中、低三个浓度进行HPLC法测定不同时间Beagle犬体内葛根素、大豆苷和染料木素的血药浓度方法学验证,以药动学计算软件对血药浓度-时间数据进行拟合。
结果:
1.正交设计实验:以枸杞子中枸杞多糖和总黄酮的总收率为考察指标,枸杞子提取物的最佳提取参数为:以固液比为1:8(g/ml)、80%乙醇、回流提取2次,每次1h,纱布过滤,合并两次滤液,枸杞子醇提后的残渣,加入10倍量蒸馏水,回流提取两次,每次1h,过滤,合并两次滤液,在40℃水浴减压浓缩,干燥即得。
2.LC-MS-MS方法检测枸杞子提取物中甜菜碱的含量:色谱柱:氨基柱(2.1×150mm,3μm);柱温:35℃;流动相:乙腈:水(80:20);流速:0.3ml/min;进样量:5μl;离子源:电喷雾离子源(ESI);离子化模式:正离子模式;扫描方式:多反应监测(MRM);干燥气温度:350℃;雾化器压力:50psi;干燥气流速:121/min;毛细管电压:4000V。
3.高、中、低浓度分别对葛根提取物中三种主要异黄酮成分进行方法学验证,并给予单剂量灌胃给药,并通过采用HPLC法对葛根提取物在Beagle犬体内药物浓度的分析,适用于生物样品测定方法要求,判定葛根提取物在Beagle犬体内为二室模型一级药代动力学过程,葛根素、大豆苷、染料木苷的消除半衰期分别为2.07±0.33、1.97±0.35、2.33±0.63h。
结论:研究的枸杞子提取物制备工艺简便、环保经济,制定了枸杞子提取物质量标准,特别对其功效成分甜菜碱的含量测定方法进行创新,进一步有效控制枸杞子提取物的质量,并在此基础上研发枸杞子保健食品实现枸杞子种植的产业多元化发展奠定基础;建立了HPLC法对葛根提取物在Beagle犬体内药物浓度的分析方法,适用于生物样品测定方法要求,为研究葛根提取物的在动物体内的药代动力学提供了可靠的方法。