肿瘤免疫疗法通过激活自身免疫系统识别和攻击肿瘤细胞,是一种有效的肿瘤治疗策略。然而,免疫抑制的肿瘤微环境严重影响了其临床疗效,尤其是肿瘤细胞高水平的糖酵解,导致葡萄糖竞争和乳酸积累,严重抑制了活化的细胞毒性T淋巴细胞的效应和功能。此外,肿瘤细胞高表达免疫抑制细胞因子以及自身低免疫原性也阻碍了T细胞免疫治疗效果。因此,抑制肿瘤细胞糖酵解,改善免疫抑制微环境对于恢复T细胞功能、提高其抗肿瘤免疫治疗具有重要意义。已有研究利用糖酵解抑制剂阻断肿瘤细胞葡萄糖摄取,然而单一的能量阻断易导致肿瘤转移,并且对免疫抑制微环境的调控效果不佳。因此,开发一种安全有效的糖酵解抑制新策略,同时调控免疫抑制微环境,有望恢复T细胞效应功能,实现高效的肿瘤免疫治疗。基于此,本课题开发了一种兼具糖酵解抑制及微环境调控作用的T细胞膜仿生钙离子调控型纳米递送系统（CaNP@TCM）,得益于T细胞表面粘附蛋白与肿瘤组织炎症内皮之间的相互作用,CaNP@TCM在肿瘤部位高效富集。随后通过T细胞膜表面的程序性细胞死亡受体1阻断肿瘤细胞表面的程序性死亡配体1,转化生长因子β受体清除肿瘤微环境中的转化生长因子β,减少对T细胞的抑制作用。CaNP@TCM被肿瘤细胞摄取后,在溶酶体酸性环境下释放大量钙离子,通过胞内钙离子干扰效应,一方面与临床糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖协同抑制肿瘤细胞糖酵解,降低肿瘤细胞葡萄糖摄取和乳酸分泌,另一方面诱导肿瘤细胞免疫原性死亡,最终提高T细胞的效应功能,实现高效的肿瘤免疫治疗。本课题从以下三个方面进行研究:1、CaNP@TCM的构建与表征采用一锅法制备具有高效钙离子释放性能的过氧化钙纳米粒,通过静电相互作用修饰DSPE-PEG2000,随后在超声作用下包覆T细胞膜得到CaNP@TCM纳米体系。首先通过透射电子显微镜、激光扫描共聚焦显微镜和电位变化证明CaNP@TCM的成功合成,激光纳米粒度仪结果显示CaNP@TCM粒径为100±1.5 nm,电位为-12.6±1.3 m V,且体外分散性及稳定性良好。钙离子释放实验表明CaNP@TCM在中性条件下稳定,随酸度的增加结构逐渐崩塌,同时释放钙离子,为实现肿瘤细胞钙离子干扰奠定了基础。2、CaNP@TCM+2-DG的体外抗肿瘤活性研究以黑色素瘤细胞B16-F10为模型,体外考察CaNP@TCM协同2-DG的抗肿瘤活性。首先,细胞摄取和细胞内钙离子分布实验证明B16-F10细胞对CaNP@TCM的摄取具有时间依赖性,随着摄取时间延长胞内钙离子水平也逐渐增加。定量葡萄糖摄取实验、糖酵解能力测定实验表明CaNP@TCM协同2-DG通过抑制肿瘤细胞糖酵解,降低肿瘤细胞葡萄糖摄取和乳酸分泌。流式细胞分析及酶联免疫吸附测定实验说明CaNP@TCM协同2-DG可以诱导肿瘤细胞免疫原性死亡,促进钙网蛋白表达和高迁移率组蛋白1胞外释放。T细胞增殖和肿瘤细胞凋亡实验说明CaNP@TCM协同2-DG治疗可以增强T细胞的增殖和效应功能,提高对肿瘤细胞的杀伤。3、CaNP@TCM+2-DG的体内抗肿瘤免疫治疗学研究以C57BL/6小鼠为动物模型,通过钙离子的电感耦合等离子体质谱考察CaNP@TCM在小鼠体内分布情况,结果表明CaNP@TCM具有良好的肿瘤靶向性和滞留性。肿瘤生长曲线、肿瘤组织图像,肿瘤组织凋亡结果说明CaNP@TCM协同2-DG通过诱导肿瘤细胞凋亡,有效抑制肿瘤生长,抑瘤率高达78.0%。肿瘤组织免疫荧光染色结果表明CaNP@TCM协同2-DG可以显著提高肿瘤细胞表面钙网蛋白表达,增加高迁移率组蛋白1的释放,降低转化生长因子β的含量。流式细胞分析结果显示,肿瘤组织内浸润的树突状细胞和干扰素-γ+CD8+T细胞比例大幅提高,同时免疫抑制性细胞,如调节性T细胞和骨髓来源抑制性细胞的浸润显著下降,这表明CaNP@TCM协同2-DG治疗后通过改善肿瘤免疫抑制微环境,激活了抗肿瘤免疫应答。免疫组化结果表明,CaNP@TCM协同2-DG治疗能提高肿瘤微环境中颗粒酶B、白介素-2、肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ的浸润。酶联免疫吸附测定实验说明CaNP@TCM协同2-DG可以降低肿瘤源性乳酸产生,增加细胞因子白介素-2和干扰素-γ的产生。小鼠体重曲线及主要组织的苏木精-伊红染色结果说明CaNP@TCM协同2-DG具有良好的生物安全性。小鼠双侧瘤模型结果表明,CaNP@TCM协同2-DG对远端瘤的生长具有显著的抑制效果,不仅激活了抗肿瘤免疫反应,同时诱导了有效的免疫记忆效应。综上所述,CaNP@TCM协同2-DG通过抑制肿瘤细胞糖酵解,降低肿瘤细胞葡萄糖摄取和乳酸分泌,为改善肿瘤免疫抑制微环境,提高T细胞的效应功能提供了一种新策略,具有潜在的临床应用价值。