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第一部分LRIG3基因特异性RNA干扰真核表达载体的构建及胶质瘤细胞系稳定株筛选目的构建LRIG3(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 3，LRIG3)基因特异的RNA干扰质粒，为探讨抑制LRIG3基因表达对脑胶质瘤细胞生物学行为调控的研究奠定基础。方法根据GenBank数据库提供的LRIG3基因核苷酸序列，选择设计2条能转录短发卡RNA(Small hairpin RNA，shRNA)的DNA序列，命名为LRIG3-shRNA1、LRIG3-shRNA2，同时设计1条非特异性序列作为阴性对照，命名negative-shRNA。并与pGenesil2质粒载体连接，转化感受态大肠杆菌，挑选阳性克隆，抽取重组质粒，使用限制性内切酶SalⅠ酶切电泳，DNA测序鉴定。3种重组表达载体转染胶质瘤细胞系GL15细胞，用G418筛选后挑单克隆并扩增获得稳定株。RT-PCR和Western blot分别在mRNA和蛋白水平上检测LRIG3的表达。结果重组质粒成功转化感受态大肠杆菌，经SalⅠ酶切琼脂糖凝胶电泳分析，表明寡核苷酸成功插入到预计位点，经测序鉴定，序列完全正确。G418筛选出稳定转染三种质粒的GL15细胞，转染pGenesil2-LRIG3-shRNA组细胞LRIG3 mRNA和蛋白表达明显低于转染pGenesil2-negative-shRNA组。结论成功构建针对LRIG3基因的特异性shRNA真核表达载体，转染细胞后可抑制LRIG3基因表达，为进一步研究其基因功能奠定了基础。第二部分LRIG3基因沉默对神经胶质瘤细胞GL15细胞系增殖及细胞周期和细胞凋亡的影响及其机制目的探讨RNA干扰沉默LRIG3基因表达对神经胶质瘤细胞系GL15增殖及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和Ki-67表达，以及对细胞周期和细胞凋亡的影响及其作用机制。方法用携带U6启动子和LRIG3特异性短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)序列的质粒载体pGenesil2-LRIG3-shRNA1、pGenesil2-LRIG3-shRNA2及含非特异性shRNA编码序列的对照质粒pGenesil2-negative shRNA(neg)转染胶质瘤细胞系GL15，G418筛选出稳定株，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测LRIG3表达的改变，应用免疫组化SABC法检测对照组和实验组GL15细胞中PCNA和Ki-67的表达；应用流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期变化，Annexin V-FITC／PI双标记分析细胞凋亡。结果shRNA1及shRNA2组细胞LRIG3 mRNA水平与对照组相比分别下降了52．4％和63．8％，LRIG3蛋白水平分别下降了50．9％和67．4％。对照组细胞PCNA阳性率为(35．40±5．69)％，shRNA1及shRNA2组细胞PCNA阳性率分别为(72．13±5．64)％和(81．93±5．23)％，差异均有统计学意义(P＜0．01)。Ki-67阳性率在对照组细胞为(49．73±5．73)％，shRNA1及shRNA2组细胞分别为(82．27±5．50)％和(88．67±3．52)％，差异均有统计学意义(P＜0．01)。Ki-67表达与PCNA表达呈正相关(r=0．932，P＜0．001)。流式细胞仪分析显示，实验组的G2／M期细胞细胞百分率比对照组明显增加，细胞增殖指数显著增加(p＜0．01)；LRIG3基因表达下调后还具有显著的抗凋亡作用(p＜0．05)。结论LRIG3特异性siRNA可明显抑制LRIG3基因的转录和表达，从而促进GL15胶质瘤细胞的增殖和使细胞周期阻滞在G2／M期并能抑制其凋亡。第三部分下调LRIG3基因表达对EGFR信号通路和GL15细胞黏附、侵袭能力的影响及机制研究目的研究RNA干扰LRIG3基因表达后对人胶质母细胞瘤GL15细胞系细胞黏附、侵袭能力的影响及其与表皮生长因子受体(EGFR)信号通路的关系。方法用携带U6启动子和LRIG3特异性短发夹RNA(shRNA)序列的质粒载体pGenesil2-LRIG3-shRNA(siRNA)及含非特异性shRNA编码序列的对照质粒pGenesil2-negative shRNA(neg)转染GL15细胞系，G418(600ng／ml)筛选出稳定株，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western-blot法检测LRIG3，EGFR和P-EGFR表达的改变。采用Transwell法和细胞基质黏附实验明确3株细胞在RNA干扰LRIG3基因表达后的侵袭能力及黏附能力，应用噻唑兰(MTT)法检测稳定转染后对GL15细胞增殖的影响。结果两实验组细胞LRIG3 mRNA和蛋白水平与对照组相比分别下降了52．4％、63．8％和50．9％、67．4％，EGFR蛋白水平上升了40．4％和95．6％，P-EGFR蛋白水平上升了26．3％和81．2％。与对照组相比，两实验组GL15细胞的侵袭能力均显著提高，其细胞黏附性也显著增加，MTT结果显示实验组细胞增殖率高于对照组。结论GL15细胞经RNA干扰基因表达后，LRIG3 mRNA和蛋白水平明显降低，同时EGFR和P-EGFR蛋白水平升高，从而提高细胞的侵袭能力和黏附性，同时可促进胶质瘤细胞的增殖。LRIG3可通过EGFR信号系统影响胶质瘤细胞的生长，有望成为胶质瘤分子治疗的靶点。