背景：肺癌是目前世界上发病率最高的恶性肿瘤之一。在中国,肺癌的发病率呈逐年升高趋势,并已成为恶性肿瘤死亡的最主要原因之一。大部分肺癌,尤其是占肺癌80%的非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer, NSCLC)患者确诊时已处于晚期,已失去了外科手术治疗的机会。因此,化疗药物成为治疗肺癌的主要手段之一,尽管治疗取得了一定的进展,但过去25年其5年生存率仍未见明显提高,仅为15%。在肺癌化疗中,以顺铂(DDP)为基础的联合化疗成为NSCLC的一线化疗药物,但由于耐药性问题使其化疗效果明显降低,这已成为目前困扰肺癌治疗的一大难题。因此,寻找更为特异的针对铂类药物耐药相关的分子靶点,如何改变肺癌铂类药物耐药性及耐药逆转机制研究成为当前国内外临床研究的热点之一。导致肺癌化疗失败的主要原因之一是多药耐药(MDR)现象的产生。MDR是指肿瘤细胞对多种化疗药物同时拥有固有或获得性交叉耐药,从而妨碍癌症有效治疗的现象。研究表明,肿瘤具有多种化疗药物耐药机制,涉及细胞生物学的各个方面,是多基因、多步骤联合作用的结果,蛋白质-酶或细胞的部分结构对MDR的产生起到关键性作用,另外,一些癌基因、抑癌基因以及细胞因子等也都可能参与了多药耐药形成的过程,其确切的耐药形成机制尚未完全清楚,但其中研究最广泛且具有多效性的MDR机制之一是转运蛋白使细胞药物流出。膜转运蛋白,包括ABC蛋白家族主要成员：P-糖蛋白(P-gp)、多药耐药相关蛋白(MRP1)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP)以及肺耐药蛋白(LRP)蛋白,通过降低细胞内药物浓度或者改变药物的分布来确定MDR的表型。目前,通过使用不同种类的MDR抑制剂来干扰这些转运蛋白将细胞内药物泵出胞外,这种方法的应用正在不同的研究阶段。人类多药耐药MDR基因主要有两种亚型,即MDR1和MDR2,其中,MDR1编码的基因产物是介导多药耐药产生的主要方式。近年来,研究最广泛的就是P-gp。 P-gp是一种的跨膜糖蛋白,分子量为170kD,由7号染色体上的MDR1基因编码。P-gp蛋白的表达量与细胞耐药性呈正相关性。在非小细胞肺癌(NSCLC)中P-gp蛋白的表达量要高于小细胞肺癌(SCLC),在肺腺癌中P-gp蛋白的表达量要高于其在肺鳞癌中的表达,P-gp蛋白在中一高分化腺癌中表达最高,这与它们对化疗药物不敏感性程度相一致。P-gp表达高低与肺癌分期无关,但与癌细胞多药耐药性、化疗药物的选择以及肺癌患者的预后有着密切联系。导致肿瘤细胞MDR现象产生的另一主要原因是肿瘤细胞对化疗药物诱导的凋亡耐受。细胞凋亡抑制基因如Bcl-2、Survivn、突变型p53等的过表达可以引起肿瘤细胞发生凋亡耐受,抑制了肿瘤细胞的凋亡,最终导致肿瘤细胞产生耐药。目前,Bcl-2蛋白已成为研究最深入、同样也是最重要的细胞凋亡抑制基因。Bcl-2基因定位于染色体18q21,在大部分癌症患者中容易导致染色体t(14；18)的易位,以致Bcl-2基因定位在14q32上,与Ig重链的转录蛋白增强子接近,从而导致Bcl-2的表达增高。Bcl-2基因的表达的升高可以促进细胞的异常增殖,同时使得化疗药物诱导的细胞凋亡受到抑制。即使化疗药物能进入细胞内,但细胞中Bcl-2基因的过表达可诱导细胞损伤,但这种损伤不能转换成凋亡的信号,以致细胞凋亡受到阻碍,因此在化疗期间高表达Bcl-2的癌细胞又能以比较快的速度再次重新生长增殖,导致多药耐药的发生。在大多数SCLC中瘤标本和细胞系中,Bcl-2表达的升高,这是与肿瘤细胞对化疗药物产生药物耐受有关。近期研究表明,与肿瘤发生发展、侵袭转移及预后密切相关的RhoE基因也影响着肿瘤的耐药性。RhoE基因属于非典型的RhoGTPase家族成员之一,其一直处于活化的GTP结合状态,最近研究发现,它在一些主要的肺癌细胞系和癌组织中的表达下调,可促进肿瘤细胞的侵袭和转移。RhoE具有许多重要的功能,它可以调节细胞骨架重组和细胞形态,影响细胞增殖、凋亡、分化等。分化抑制因子(Id),属于螺旋-环-螺旋(HLH)转录因子家族成员,因缺乏与DNA结合区域而对碱性HLH (bHLH)转录因子起负调节作用。到目前为止,在哺乳动物中共发现4种Id蛋白,即Id1、Id2、Id3和Id4。近几年的研究表明,Id蛋白家族具有比较广泛的生物学功能,包括：调控细胞命运和细胞定向分化、维持细胞存活、促进血管、胚胎和器官的形成、诱导细胞发生凋亡及肿瘤侵润等癌蛋白功能,同时还具备抑制细胞分化和促进细胞增殖的功能。Id蛋白特别是Id1蛋白,不仅参与正常细胞的生长发育,在许多肿瘤细胞中也呈现高表达,已有研究发现,Id1在肿瘤细胞中的表达水平与肿瘤细胞的侵袭转移密切相关。Lwatsuki发现,在发生淋巴结转移和腹腔转移的胃癌患者中,Id1蛋白在骨髓和外周血中的表达水平要明显高于没有远处转移的胃癌患者,并提出骨髓和外周血中Id1是监测胃癌发生淋巴结和腹腔转移的“真正的指标”。大量研究已证实Id1在肿瘤细胞中的表达及表达程度与肿瘤细胞的分化及细胞侵袭能力相关,被研究者们认为是一种“准癌基因”,因此得到学者们的广泛研究。目前,Id1在肿瘤中发挥的生物学作用已得到普遍认可,与Id1相比,因为Id3基因表达调控机制的复杂性决定了其功能的多样性,因此,有关Id3基因在细胞周期调控中的作用及其作用机制尚有待进一步深入研究。1991年,有研究学者首次发现了Id3基因,它被称为体外培养小鼠成纤维细胞过程中血清诱导表达的立即早期基因。Id3的表达既广泛,又有细胞类型的特异性,决定了其基因调控机理的复杂性。Id3在细胞中的表达模式和调控机制与Id1不完全相同,在不同种类的肿瘤组织和肿瘤细胞系中,Id3具有截然不同的表达,在人小细胞肺癌和原发性结直肠癌中表达量较高,而在前列腺癌、卵巢癌及甲状腺癌中表达水平低下。小鼠Id3基因敲除(Id3-/-)可导致小鼠发生与人类相似的γδ T细胞淋巴瘤,提示γδ T细胞淋巴瘤患者体内可能存在Id3基因的突变。在我们的前期体外实验研究中发现：①Id3在正常人PBMC中未见表达,而在不同肿瘤细胞中的表达程度则有较大差异,在人前列腺癌细胞PC-3M中Id3表达水平最高,要明显高于肺腺癌细胞(A549)、卵巢癌细胞(COC2)、Burkitt’sB淋巴瘤细胞(Daudi). T淋巴细胞性白血病细胞(Jurkat)等；②用间接免疫荧光试验(IFA)对A54、PC-3M和人乳腺上皮癌细胞(MCF7)中Id3蛋白的表达分布进行检测的结果表明,A549细胞内Id3蛋白表达量要明显低于MCF7和PC-3M细胞。以上结果表明,Id3的表达是根据其所在细胞的种类和生长发育阶段的不同而呈现不同的水平,从而执行各种特殊的细胞生物学功能。据有关文献报道,Id3除了具有促进细胞周期进程,抑制细胞分化的功能外,在细胞凋亡方面也发挥着极其重要的作用。早在2001年,Kee等就发现通过采用逆转录病毒载体将Id3导入人B淋巴细胞前体(B lymphocyte progenitors>BLPs)内,可导致BLPs出现增殖抑制以及凋亡,通过模拟TGF-β的作用,外源性Id3在BLPs中的过度表达可诱导BLPs发生凋亡现象。最近,Lee等研究也发现,经过X射线照射的小鼠表皮组织和HaCaT角质形成细胞可以导致细胞内Id3表达的上调,Id3重组腺病毒在HaCaT细胞中的表达可以诱导细胞发生凋亡,并能显著增加X射线诱导细胞凋亡的敏感性。我们在前期研究中发现：①将表达载体pEGFP/Id3导入A549细胞,使EGFP-Id3融合蛋白在A549细胞中得到表达,MTT实验、Annexin V/7AAD-FCM凋亡检测以及Hoechst 33258核染色法结果均表明,Id3转基因表达可诱导A549细胞发生增殖抑制和凋亡；②用RNA干扰技术成功构建靶向人Id3基因的miPNA干扰载体(pcDNA/miRId3),体外抑制A549细胞中Id3的表达,可逆转外源性Id3表达对细胞增殖的抑制和致凋亡作用：③将Id3基因克隆至腺病毒表达载体pAxCAwtit,转染293细胞后制备出重组腺病毒Ad-Id3,结果表明,腺病毒介导的Id3转基因表达可以抑制A549细胞增殖。以上结果提示,Id3在A549细胞中转基因表达可诱导细胞增殖抑制和凋亡。Id作为抗肿瘤药物所致凋亡的负性调节子,可望成为增强化疗敏感性的新型治疗靶点。在顺铂诱导肉瘤系MG63细胞凋亡的实验中,Id3的过表达可以增强MG63细胞对顺铂诱导凋亡的敏感性。有研究表明,Id1不仅作为肺腺癌预后判断的标志分子物质,而且通过下调Idl的表达可以增强肺腺癌放化疗的敏感性,但其具体作用机制目前尚不清楚。Li等发现,通过下调Idl的表达可以增强胃癌细胞MGC803和AGS顺铂耐药的敏感性；同时,Lee也发现在转录水平通过下调p53表达可以负调控PTEN蛋白,从而导致PI3K/Akt/Wnt信号通路的激活,引起细胞增殖的发生,故认为PI3K/Akt信号通路可能参与了Idl的生物学作用,如细胞增殖、抗凋亡侵袭和转移等多种生物学效应。最近研究也发现,Id1和Id3可以作为非小细胞肺癌Ⅲ-N2期患者化疗治疗的预后标志物,这两种蛋白可能在肿瘤治疗方法上发挥不同作用,尤其是肿瘤化疗的治疗上。顺铂是一种细胞周期非特异性的细胞毒性化疗药物,其主要作用靶点是DNA,其主要作用机制是作用于DNA链间及链内交链,形成DDP-DNA复合物,干扰DNA复制或与核蛋白及胞浆蛋白结合,引起癌细胞DNA的复制障碍,使增殖迅速的细胞停滞在G2/M期,诱导细胞凋亡,具有较强的广谱抗癌作用。目前认为抗癌细胞凋亡、损伤修复过程中DNA剪切物的增加、与调控信号通路相关的调节蛋白表达的改变、药物摄取减少导致细胞内DDP浓度降低等均可能与顺铂的耐药有关,然而肺癌细胞对其耐药的机制尚未完全阐明。目前认为肺癌顺铂耐药机制的研究主要在以下几个方面：1、由药物摄取障碍或药物外排增加介导的细胞内药物浓度的降低;2、DNA损伤修复功能的异常；3、细胞解毒功能的增强；4、细胞凋亡的抑制等方面。因此,进一步研究顺铂的耐药机制和寻找新的逆转耐药靶点对于改善肺癌化疗效果提高5年生存率具有重要意义。顺铂抗肿瘤作用的主要机制是诱导肿瘤细胞发生细胞凋亡。体内外研究发现,肿瘤细胞凋亡发生改变主要由于细胞凋亡信号转导通路异常,凋亡相关因子表达异常引起。我们前期研究证明：Id3的过表达可导致A549和A549/DDP细胞发生凋亡。最近研究发现,PI3K/Akt通路是最主要的抗凋亡通路之一,同时也发现PI3K/Akt信号通路在肿瘤耐药方面也发挥着重要作用。因此我们推测：Id3可能通过PI3K/Akt信号通路来调控肺腺癌顺铂耐药的。因此,本课题拟以非小细胞肺癌细胞及其顺铂耐药细胞为主要研究对象,在细胞过表达Id3情况下,分别观察在加入顺铂前后细胞生物学行为及对顺铂耐药的变化,了解Id3是否与肺癌顺铂耐药有关,研究Id3的过表达对细胞顺铂敏感性的影响。在此基础上,初步阐明Id3调控肺腺癌细胞顺铂耐药性的分子机制,为进一步分析Id3能否成为逆转肺腺癌顺铂耐药的分子靶点提供一定的理论基础及实验依据。本研究按以下三部分进行：第一部分：A549/DDP细胞耐药性分析及细胞内Id3基因和蛋白质表达水平的研究目的：分析A549/DDP细胞对顺铂的耐药性,以及细胞内Id3基因和蛋白的表达水平,为后续实验奠定一定的实验基础。方法：1.采用CCK-8法测定不同浓度的DDP对A549/DDP和A549细胞的生长抑制作用,并计算其半数抑制浓度(IC50)和耐药指数；2.采用RT-PCR、Western Blot方法检测Id3在A549/DDP中mRNA及蛋白的表达水平。结果：1.在体外细胞培养条件下,用不同浓度的DDP处理A549/DDP和A549细胞,24h后用CCK-8实验检测细胞活力,结果发现,DDP在5μg/ml浓度时能显著抑制A549的增殖,对A549/DDP耐药细胞的增殖有一定的抑制作用,但存在较明显的耐受现象,在较高浓度(20μg/ml)时才显示出一定的抑制作用。DDP对细胞的抑制呈浓度依赖性,根据直线回归计算出两株细胞对DDP的半数抑制浓度(IC50),DDP对A549细胞的IC5o为5.32μg/ml,对A549/DDP细胞的ICso为19.38μg/ml,可见A549/DDP细胞对DDP的耐药指数为3.64；2. RT-PCR及Western Blot结果显示,Id3 mRNA和蛋白质在A549/DDP和亲代A549细胞中均呈低水平表达,两株细胞无明显差异。结论：1.DDP对亲本细胞株A549和耐药细胞株A549/DDP的抑制作用呈浓度依赖性；A549/DDP细胞对DDP的耐药指数为3.64；2.Id3在A549/DDP细胞中表达水平低下。第二部分：Id3基因在A549/DDP细胞中的过表达及其逆转顺铂耐药性的作用研究目的：初步探讨凋亡诱导因子Id3对A549/DDP(?)铂耐药性的逆转作用。方法：1.用脂质体LipofectamineTM2000转染技术将Id3表达载体pEGFP/Id3分别导入A549和A549/DDP细胞以及人肺腺癌细胞SPC-A-1,荧光倒置显微镜下观察三组细胞内EGFP-Id3融合蛋白表达情况,倒置显微镜观察Id3基因表达前后细胞的形态学变化；2.用脂质体LipofectamineTM2000将pEGFP/Id3分别导入A549细胞和A549/DDP细胞,采用荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测Id3 mRNA的表达；3.采用CCK-8法检测Id3基因过表达对A549/DDP细胞耐药性的逆转作用；4.将Id3基因导入A549/DDP,加入不同浓度的DDP (0.0μg/ml,1.0μg/ml, 2.0μg/ml),24h后采用Annexin V-FITC和PI双染法和流式细胞仪测定细胞凋亡率。结果：1.荧光显微镜下观察,未转染质粒的细胞组中无绿色荧光,转染pEGFP/Id3重组质粒的各组细胞中绿色荧光主要表达于细胞核,转染空载体pEGFP质粒的各组细胞中绿色荧光多表达于全细胞,荧光呈弥漫状,分布均匀,无明显细胞浆及细胞核的差异；2. qRT-PCR结果显示,与空白细胞组及转染空载体pEGFP组相比,转染pEGFP/Id3组A549/DDP细胞中Id3 mRNA表达水平显著升高(P<0.05)；3.CCK-8结果显示,Id3基因导入A549/DDP细胞后,DDP对A549/DDP的半数抑制浓度(ICso)由19.38降至11.71,逆转倍数为1.66倍；4. Annexin V-FITC和PI双染结合流式细胞术测定细胞凋亡率结果显示,与空载体pEGFP对照组相比,转染PEGFP/Id3组A549/DDP细胞凋亡率明显增加(P<0.05),且随DDP浓度的增高凋亡率随之增加,提示Id3基因与DDP对细胞生长的抑制效应具有协同作用。结论：Id3基因与DDP对细胞的抑制效应具有协同作用,Id3基因过表达后耐药的A549/DDP细胞对DDP的敏感性明显增加,细胞凋亡增多,耐药得以部分逆转。第三部分：Id3逆转A549/DDP顺铂耐药性的作用机制分析目的：探讨Id3逆转A549/DDP顶铂耐药性可能作用机制。方法：1. Western blot法和qRT-PCR法检测A549/DDP细胞中多药耐药蛋白MDR、 RhoE和Bcl-2蛋白表达,以及Akt磷酸化的变化；2.流式细胞术检测A549/DDP细胞多药耐药蛋白MDR含量的变化。结果：1. qRT-PCR法检测结果发现,与对照组相比,Id3基因转染A549/DDP细胞中肿瘤耐药相关基因MDR和Bcl-2 mRNA表达水平明显下调(P<0.05)；2. Western blot法检测结果表明,与对照组相比,Id3转染基因A549/DDP细胞中肿瘤耐药相关基因MDR和Bcl-2蛋白表达水平明显下调,而RhoE的表达量明显升高(P<0.05)；3.Western blot法检测也发现,与对照组相比,Id3基因转染A549/DDP细胞中p-Akt的表达量明显下降(P<0.05),提示Id3可能通过抑制PI3K/AKT信号通路的活性,抑制细胞的增殖,促进其凋亡,从而逆转其耐药性,并且Id3在此通路中具有负向调节作用。4.流式细胞术检测A549/DDP细胞多药耐药蛋白MDR含量的变化发现,与空载体pEGFP转染组相比,Id3转染A549/DDP细胞中MDR蛋白含量降低,差异有统计学意义(P<0.05),与Vestern blot检测结果一致。结论：Id3可逆转A549/DDP对顺铂的耐药性,其机制可能与抑制药物外排,负调控肿瘤耐药相关蛋白的表达,促进细胞凋亡有关。