[目的]铝在地壳中含量第三,是最丰富的金属元素。铝拥有诸多优良的理化特性,因此被普遍应用于医疗、食品、工业、农业等领域。机体摄入铝的机会非常多,除去含铝药品引起的铝吸收以及职业性铝暴露外,水、食品添加剂、食品包装材料、铝制器皿溶解出的铝也是人体吸收铝的主要途径,但是机体排铝的途径比较少,一般通过尿液和粪便排出,因此吸收的铝非常容易在体内蓄积。铝曾经被认为是一种吸收率很低且对人体无害的元素,但近几十年来已有研究表明铝的蓄积会对多种器官和组织造成毒性作用。尤其是铝对神经系统的毒性作用在近些年来备受关注,铝对神经系统的危害主要体现在对学习和记忆功能的影响,并导致细胞凋亡。黄酮类化合物被用作食品补充剂,其改善认知功能和预防人类的神经退行性疾病的作用已得到重视。但是其种类繁多,具有多种亚类,关于不同亚类预防和治疗神经退行性疾病的效果鲜有报道。本实验选取Wistar大鼠为研究对象,通过灌胃的手段给予铝盐构建染毒模型,然后给与三种有代表性的黄酮类化合物芦丁(黄酮醇类)、水飞蓟素(二氢黄酮醇类)、葛根素(异黄酮类)进行解毒。通过行为学实验评估这三种不同亚类的黄酮类化合物干预对染铝大鼠在学习、记忆能力方面的改善作用;通过分子学实验检测海马细胞凋亡总体情况、与凋亡相关的基因和蛋白表达水平以及与自噬相关的蛋白表达水平,研究并探讨这三种亚类的黄酮类化合物拮抗染铝大鼠学习记忆能力损伤和细胞凋亡的作用。[方法]1.动物建模80只健康雄性Wistar大鼠按体重(200 g±20g)随机分为8组,分别为阴性对照组(con)、铝染毒组(tox)、芦丁低剂量组(R-L)、芦丁高剂量组(R-H)、葛根素低剂量组(P-L)、葛根素高剂量组(P-H)、水飞蓟素低剂量组(S-L)、水飞蓟素高剂量组(S-H),每组10只。con组始终给以1ml/d生理盐水;其余各组连续4周采用灌胃方式给以铝盐,1天1次分别给予281.40 mg/kg AIC13溶液;后8周,tox组每天1次给以1 ml生理盐水,各解毒组每天按低高剂量分别为100mg/kg和200mg/kg给以相应的芦丁、葛根素、水飞蓟素的水溶液。在此期间,所有大鼠每3天称量1次体重,并根据大鼠体重对灌胃量做出相应调整。2.动物处理从每组中随机选择2只大鼠,选用1%戊巴比妥钠为麻醉剂,通过腹腔注射进行麻醉。用生理盐水逐渐替代大鼠体内血液后,用4%多聚甲醛进行灌注,速度先较快后较慢,时间大约在30～40 min,当发现大鼠肝脏开始变硬发白,则说明心脏灌注已经完全。立即分离出脑组织,浸泡在4%的多聚甲醛里固定形态,以备制作石蜡切片。剩余的大鼠在水迷宫实验结束之后禁食24h,称重后进行断头处死,于冰上迅速分离出脑组织和海马,用0℃生理盐水洗涤,然后在液氮中快速冷冻,最后在-80℃下保存,为后续实验做准备。3.铝染毒大鼠学习记忆能力的评估和测定采用Morris水迷宫实验评价黄酮类化合物干预对铝染毒大鼠学习记忆功能的影响。实验分为训练和测试两个阶段,持续5天。在第1-4天为训练期,通过测定大鼠的潜伏期和游泳总路程,来评价三种亚类的黄酮类化合物对铝染毒大鼠学习功能的改善作用;第5天为测试期,通过测量大鼠目标象限游泳时间和穿越平台次数,评价三种亚类的黄酮类化合物对铝染毒大鼠记忆功能的改善作用。4.铝染毒大鼠海马细胞凋亡和自噬水平的测定在整个喂养阶段结束之后,每组选2只大鼠麻醉后做心脏灌注,断头后迅速取出脑组织,在4%多聚甲醛中浸泡固定形态至少24h,制作石蜡切片。剩余大鼠禁食后断头处死,于冰上迅速分离脑组织和海马。选择TUNEL法检测各组大鼠海马细胞总体凋亡情况;RT-PCR法检测Bcl-2和Bax的mRNA表达水平;western blot法检测Bcl-2、Bax、Beclin-1和LC3的蛋白表达情况,研究这三种亚类的黄酮类化合物对铝染毒大鼠海马细胞凋亡的保护作用。[结果]1.黄酮类化合物干预对铝染毒大鼠学习记忆能力的影响训练期间,随着训练天数增加,潜伏期(S)和游泳总路程均呈现下降趋势,与其他组相比,tox组下降速度较为缓慢,各组之间没有统计学差异(P>0.05)。测试期间,对比con组,tox组大鼠的目标象限游泳时间和穿越平台次数均显著减少,差异具有统计学意义(P<O.05)。各解毒组大鼠目标象限游泳时间和穿越平台次数较tox组具有不同程度的增加,其中R-H组和P-H组大鼠目标象限游泳时间显著增加(P<0.05);R-H组,P-L组、P-H组大鼠穿越平台次数显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。R-H组、P-H组大鼠与其低剂量组相比,目标象限游泳时间和穿越平台次数显著增加(P<0.05),而水飞蓟素组大鼠的结果则相反,对比S-L组,S-H组大鼠目标象限游泳时间和穿越平台次数有所减少。2.黄酮类化合物干预对铝染毒大鼠海马细胞凋亡情况的影响Con组脑组织切片可以观察到的凋亡细胞数量极少,与con组相比,tox组大鼠的脑组织切片显示海马神经元细胞变性,伴有凋亡神经元(棕黄色神经元)。R-L组、R-H组、P-L组和P-H组大鼠的脑组织切片结果显示,与tox组相比,铝诱导的凋亡细胞数量明显减少,并且R-H和P-H组凋亡细胞数量比R-L组和P-L组少。然而,S-L组与tox组对比,凋亡细胞数量减少,但S-H组脑组织切片中仍然可以观察到大量的凋亡细胞,与tox组对比并未有明显的凋亡细胞数量的减少。与con组相比,tox组大鼠Bax mRNA和Bax蛋白表达量显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05);与tox组大鼠相比,除了S-H组以外,各解毒组大鼠Bax mRNA和Bax蛋白表达量显著减少(P<0.05),且R-H组和P-H组Bax mRNA和Bax蛋白表达减少量比低剂量组更多。各组大鼠之间Bcl-2蛋白表达量没有显著差异(P>0.05),但tox组大鼠Bcl-2蛋白表达量与con组相比有减少的趋势。3.黄酮类化合物对铝染毒大鼠细胞自噬水平的影响与con组相比,tox组大鼠Beclin-1蛋白表达量显著减少,差异具有统计学意义(P<0.05);与tox组大鼠相比,R-L组、P-H组、S-L组和S-H组大鼠Beclin-1蛋白表达量显著增加(P<0.05)。与con组相比,tox组大鼠LC3蛋白表达量显著减少(P<0.05);与tox组大鼠相比,各解毒组大鼠LC3蛋白表达量显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。[结论]1.黄酮类化合物能显著改善铝染毒大鼠的学习记忆能力。2.芦丁、葛根素和低浓度的水飞蓟素能有效地调控海马细胞凋亡和自噬相关的蛋白表达,缓解细胞凋亡并提高细胞自噬水平,对铝染毒大鼠神经系统起到保护作用。3.较高浓度的水飞蓟素通过提高海马细胞自噬水平来拮抗铝致海马细胞凋亡。4.黄酮类化合物对铝染毒大鼠脑组织的形态损伤有一定的保护作用。