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研究背景:腰痛的主要原因之一是腰椎间盘退行性变。由于全球人口老龄化、生活方式的改变和工作压力的增加,腰痛的发病率可能会逐年增加。这给许多患者带来了巨大的健康困扰。虽然目前已有理疗、药物治疗等保守疗法以及微创或开放手术等外科治疗手段,但它们只能缓解或改善临床症状,并且常常伴随着脊柱功能丧失、运动障碍和椎间盘生物力学改变,最终可能导致邻近椎间盘退变。鉴于传统治疗的局限性,生物再生疗法已成为目前研究的热点。利用干细胞分化为髓核细胞的干细胞疗法可为退变的椎间盘提供足量且稳定的细胞来源,为维持椎间盘生物力学功能、逆转椎间盘退行性变提供了可能。目前已有多项相关研究报道。其中,本课题组研究表明髓核细胞来源的外泌体可以在体外诱导MSCs分化为髓核细胞,并且其诱导效果显著高于非接触式共培养。但是髓核细胞外泌体诱导MSCs向髓核细胞分化的具体作用机制尚未明确。Notch通路是一条与细胞增殖,分化,迁移等生物行为密切相关的经典通路。已有多项研究报道Notch通路参与调控了多种干细胞的分化。因此,本研究拟探究Notch通路在髓核细胞外泌体诱导下MSCs向髓核细胞分化中的作用机制。方法:1.1)从SD大鼠尾椎椎间盘和骨髓中分别提取髓核细胞和MSCs。通过流式细胞术鉴定MSCs表面标志蛋白,并成骨、成脂和成软骨诱导分化证明其多向分化能力。2)通过差速离心法提取髓核细胞外泌体,透射电子显微镜直接观察外泌体大小和形态,并使用Western blot检测外泌体经典标志蛋白CD63,CD81,TSG101的表达。3)分别使用荧光探针CM-DIO和CM-DIL标记MSCs和髓核细胞外泌体,共培养24h后在荧光显微镜下观察MSCs对髓核细胞外泌体摄取情况。2.1)外泌体诱导MSCs分化7、14、21天后,使用RT-PCR和Western blot检测MSCs的COL2、ACAN和Sox9基因和蛋白表达。2)Transwells小室用于构建髓核细胞和MSCs的非接触式共培养系统。将第三代BMSCs分为三组:外泌体组:加入髓核细胞外泌体(50μg/ml);共培养组:与髓核细胞非接触式共培养;对照组:不加处理。在第14天应用RT-PCR和Western blot检测3组的COL2、ACAN、Sox9的mRNA和蛋白表达量,以对比外泌体与共培养之间的诱导效率。3)使用慢病毒敲减Rab27a蛋白以抑制髓核细胞分泌外泌体。差速离心法收集髓核细胞外泌体并使用BCA法测定外泌体浓度。成功抑制髓核细胞释放外泌体后,使用Transwells小室建立髓核细胞与MSCs的非接触式共培养系统,共培养14天后应用RT-PCR和Western blot检测各组的COL2、ACAN、Sox9的mRNA和蛋白表达量,探究髓核细胞外泌体在非接触式共培养中的作用。3.1)外泌体诱导14天后使用RT-PCR和Western blot检测Notch通路相关基因和蛋白的表达变化。2)使用DAPT和SJAG分别抑制或增强Notch1通路在MSCs中的表达,并使用RT-PCR和Western blot检测MSCs的COL2、ACAN和Sox9基因和蛋白表达,以证明Notch1通路在MSCs分化中的作用。3)使用慢病毒转染以敲低Notch1蛋白在MSCs中的表达,进一步证明Notch1通路在MSCs分化中的作用。结果:1.1)原代大鼠髓核细胞形态不规则,呈短棒状、梭形或多角形。第三代大鼠髓核细胞形态规则,呈长梭形,均匀分布。原代MSCs呈集落分布,周围散在分布许多杂细胞。第三代MSCs为长梭形,旋涡状排列。MSCs高表达CD29(100%)、CD44(98.8%)、CD90(99.7%),低表达CD34(1.57%)、CD45(6.9%).MSCs成骨、成脂、成软骨诱导后染色分别可见钙结节形成、脂滴形成和糖胺聚糖积累。2)透射电镜观察外泌体为30-100nm类圆形双层膜结构,其表达CD63、CD81、Tsg101蛋白,不表达Calnexin蛋白。3)荧光显微镜下CM-DIL标记的外泌体可被CM-DIO标记的MSCs摄取。2.1)外泌体诱导MSCs分化7、14、21天后,RT-PCR和Western blot检测结果显示MSCs的COL2、ACAN和Sox9基因和蛋白表达均显著高于对照组并且呈逐渐升高趋势(p<0.05)。2)MSCs分别与髓核细胞非接触式共培养和外泌体诱导14天后,外泌体组的COL2、ACAN和Sox9基因和蛋白表达均显著高于共培养组(p<0.05)。3)慢病毒转染后,髓核细胞的Rab27a蛋白表达下降。BCA法检测结果显示髓核细胞分泌外泌体的量也明显随之下降。成功抑制髓核细胞释放外泌体后,Western blot检测结果显示非接触式共培养中MSCs的COL2、ACAN和Sox9表达也随之下降(p<0.05)。3.1)在外泌体诱导14天后,RT-PCR和Western blot检测结果显示MSCs的Notch1蛋白及其下游分子Hes1、Hey1的表达量显著下降(p<0.05)。2)DAPT作用于MSCs14天后Notch1蛋白及其下游分子Hes1、Hey1的表达量明显下降(p<0.05),并且MSCs的COL2、ACAN和Sox9基因和蛋白表达呈升高趋势(p<0.05)。SJAG作用于MSCs 14天后Notch1蛋白及其下游分子Hes1、Hey1的表达量显著升高(p<0.05),并且MSCs的COL2、ACAN和Sox9基因和蛋白表达明显下降(p<0.05)。3)慢病毒转染MSCs后Notch1蛋白表达明显下降,COL2、ACAN和Sox9表达也随之下降。结论:1)本研究成功提取了大鼠髓核细胞和MSCs,并证明所提取的MSCs高表达干细胞标志蛋白并且具有多向分化能力。经透射电镜观察和Western blot检测外泌体表面标志蛋白鉴定了所提取的髓核细胞外泌体,并证明了该外泌体可被MSCs摄取。2)髓核细胞外泌体可诱导MSCs向髓核细胞分化,并且髓核细胞外泌体对MSCs向髓核细胞分化的诱导效率高于非接触式共培养。3)在非接触式共培养体系中,通过敲减髓核细胞Rab27a蛋白可显著抑制髓核细胞外泌体释放,并抑制MSCs向髓核细胞分化作用。证明外泌体在非接触式共培养中对MSCs向髓核细胞分化起到了关键的介导作用。4)Notch1通路表达与外泌体诱导下的MSCs分化呈负相关。抑制Notch1通路表达可促进MSCs向髓核细胞分化。