近年来，细胞凋亡在线虫、果蝇、哺乳动物三大模式生物的研究中取得了丰硕的成果。家蚕作为鳞翅目昆虫的典型代表，也是良好的模式生物，但对其细胞凋亡的研究尚处于初级阶段。Bcl-2基因作为细胞凋亡线粒体途径中的关键调节基因，自从1985年Tsujimoto等在研究滤泡状B细胞淋巴瘤时发现以来，受到广泛的关注。该基因是一个原癌基因，它本身既不能促使恶性转化，也不能促进细胞增殖，但它可以在无神经营养因子和生长因子的条件下延长细胞的存活时间。Bcl-2对于由多种细胞毒素引起的细胞凋亡均有抑制作用。本文基于其他模式生物的先进研究成果及家蚕基因组信息，分析并克隆了果蝇Buffy基因的家蚕同源基因Bmbuffy，并对其表达进行了研究，得到了如下研究结果。　　 1家蚕Bmbuffy基因的克隆及序列分析　　 利用家蚕EST数据电子克隆了果蝇Dmbuffy基因在家蚕中的同源体。命名为Bmbuffy。通过Race技术成功克隆了家蚕BmBuffy基因的完整cDNA序列，全长为1632bp，其ORF长879bp(ORF：362-1241)，编码292个氨基酸，预测蛋白的分子量大小为32.4kDa，等电点为9.94。通过结构域预测，编码蛋白的第130个氨基酸到第241个氨基酸之间，有一个Bcl-2家族的保守结构域。基因组序列分析结果显示BmBuffy基因由6个外显子组成，外显子/内含子边界符合GT-AG规则；前5个外显子位于7号染色体的两条scaffold上，而第6个外显子位于4号染色体上。　　 2家蚕Bmbuffy基因的原核表达　　 根据BmBuffy基因的完整cDNA序列设计引物，体外克隆BmBuffy基因的ORF。将整个编码区序列亚克隆到pET-28a-c(+)表达载体，构建重组表达质粒，将该重组质粒转化到BL21表达宿主菌中，用IPTG诱导Bmbuffy/pET-28a-c(+)/BL21表达目的蛋白。由于加了组氨酸标签，目的蛋白大小为36.2kD，与预测结果一致。该蛋白以包涵体的形式存在。IPTG浓度，诱导温度和诱导时间对Bmbuffy蛋白的表达影响不大，本实验最终采用1.0mM IPTG、37℃诱导4h来诱导目的蛋白的表达。　　 3家蚕Bmbuffy蛋白抗体的制备　　 以纯化的Bmbuffy蛋白为抗原制备了抗体，并用饱和硫酸铵盐析法纯化，通过间接ELISA法检测抗体效价为1:32000。　　 4家蚕Bmbuffy基因在凋亡细胞中的表达　　 将正常BmE-SWU1细胞、UVC和放线菌素D凋亡诱导后24 h的BmE-SWU1细胞进行凋亡检测并对家蚕Bmbuffy、BmDredd和BmGsk3基因进行表达谱分析。结果显示，UVC和放线菌素D诱导后的BmE-SWU1细胞中，核固缩，染色质凝集，最后核裂解，可见清晰的荧光碎片凋亡小体，呈现典型的细胞凋亡特征；放线菌素D诱导后的BmE-SWU1细胞中，Bmbuffy、BmGsk3基因的表达量有所下降，但不太明显，BmDredd基因的表达量上升；UVC诱导后的BmE-SWU1细胞中，Bmbuffy和BmDredd基因的表达量显著下降，BmGsk3基因表达量明显上升。利用制备的Bmbuffy抗体对三个样品中的Buffy蛋白进行Western blotting检测，结果与表达谱分析一致，推测Bmbuffy具有抑制细胞凋亡的功能。