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乙型肝炎(Hepatitis B)由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)引起，是全球最常见的传染病之一。中国每年因乙肝感染导致死亡的人数约占全球HBV感染相关死亡人数的近50％。接种乙肝疫苗是目前防控乙型肝炎的最重要策略。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是乙肝疫苗的主要活性物质。
HBsAg是由多个单体通过二硫键形成的球形病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)，作为一种多聚亚基蛋白，HBsAg稳定性较差，尤其是在纯化过程中，因其易发生解聚或聚集等结构变化而造成活性损失，导致产率下降，对乙肝疫苗大规模生产造成极大的负面效应。保护抗原的完整性是解决这一问题的重要手段之一。基于此，本文使用硅胶进行初步吸附/解吸附实验，发现其可增强抗原颗粒稳定性和完整性;进一步探究不同pH条件下的抗原颗粒稳定性，基于此，对硅胶实验中吸附与解吸附步骤进行优化，得到最佳的纯化方案;再与组合层析联用进一步纯化抗原，采用穿透式离子交换层析，保护抗原结构，提升层析纯化中抗原的活性收率。如下所述:
1、在硅胶对抗原颗粒稳定性和完整性分析研究中，对细胞破碎液进行硅胶处理，将洗脱液进行疏水层析纯化，颗粒完整性为85.79％，活性收率是49.73％。传统疏水层析方法的颗粒完整性为64.89％，活性收率为17.74％，两者相比较发现采用硅胶吸附/解吸附与疏水层析联用的纯化方法，颗粒完整性提高20.90％，抗原活性收率提高31.99％;将纯化后得到的抗原颗粒进行稳定性分析，发现经硅胶处理后，稳定性为57.60％，而传统疏水层析纯化抗原的稳定性为34.73％，相比较增加了22.93％;表明在疏水层析实验前加入硅胶纯化步骤有助于提升抗原颗粒的活性回收率和颗粒完整性，并且保持其稳定性。
2、在硅胶吸附/解吸附过程对HBsAg颗粒稳定性和完整性的影响研究中，首先利用单因素实验探究抗原浓度、吸附pH、吸附时间、解吸附pH、解吸附温度五种影响因素对活性收率以及蛋白收率的影响，并用高效液相凝胶过滤色谱(HPSEC)分析不同影响因素对抗原颗粒完整性的影响，结果表明:1g干硅胶对抗原的有效吸附量为47.85mg，小体系吸附实验仅需30min，达到吸附平衡，吸附pH在8左右，活性收率和蛋白收率较高，提高解吸附pH，活性收率和蛋白收率都会逐步上升，在pHIO左右最佳，而解吸附温度则是在55℃时，收率最佳。综合以上五种影响因素，HPSEC分析发现中大颗粒占比与活性收率呈现正相关的关系。同时利用静态光散射、荧光光谱和动态光散射等分析手段，从颗粒完整性角度研究抗原颗粒在不同pH条件下的稳定性变化，结果表明在酸性溶液中，pH接近HBsAg等电点时，抗原颗粒问静电斥力减小，颗粒容易聚集;碱性条件下，抗原颗粒内部疏水基团暴露，造成颗粒解聚。综合单因素实验结果以及静态光散射、荧光光谱和动态光散射结果分析，指导硅胶吸附/解吸附纯化HBsAg，建立该过程中关键因素的响应面模型，以活性回收率为响应值时，最佳纯化工艺为吸附pH=7.43，洗脱pH=10.48，洗脱温度55.4℃，此时活性收率最高为39.1％;以纯化倍数为响应值时，吸附pH=7.16，洗脱pH=10.52，洗脱温度55.1℃，此时纯化倍数最高为1.90。
3、探究出一条基于硅胶吸附和解吸附的组合层析法纯化HBsAg。初步探究疏水层析和离子交换层析对硅胶解吸附液的纯化效果，发现疏水层析具有载量大、核酸去除率高、产品纯度高特点，因此选择疏水层析作为组合层析第一步。在疏水层析实验中，首先对硅胶解吸附液进行pH和硫酸铵稳定性影响实验，发现硅胶解吸附液在pH7.5和6％硫酸铵条件下，活性保持最佳;并利用静态吸附实验考察丁基硫介质、丁基介质、低密度苯基介质、高密度苯基4种疏水层析介质对硅胶解吸附液的吸附和洗脱能力，发现疏水能力越强，蛋白越不容易洗脱，层析收率越低;利用动态实验对丁基硫疏水介质和丁基疏水介质进行柱实验纯化发现丁基硫疏水层析活性收率为54％，是丁基疏水层析的9倍;但是丁基硫疏水层析得到的洗脱液中，存在不完整组装的HBsAg颗粒，需要利用DEAE离子交换层析去除。在DEAE离子交换层析实验中，发现洗脱式得到的蛋白收率为4％，活性收率为45％，HBsAg收率低;提出穿透式纯化，发现活性收率提高51％,蛋白回收提高33％，最终得到一条硅胶—疏水层析—穿透式离子交换层析纯化HBsAg的路线，实现在提高疫苗收率的同时，去除不完整组装HBsAg颗粒的最终理想效果。纯化路线经初步放大，最终蛋白收率为3.94％，疫苗活性收率为40％，达到电泳纯(SDS-PAGE)和色谱纯(HPSEC)，经透射电镜观察到抗原颗粒粒径为20～40nm。
HBsAg是由多个单体通过二硫键形成的球形病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)，作为一种多聚亚基蛋白，HBsAg稳定性较差，尤其是在纯化过程中，因其易发生解聚或聚集等结构变化而造成活性损失，导致产率下降，对乙肝疫苗大规模生产造成极大的负面效应。保护抗原的完整性是解决这一问题的重要手段之一。基于此，本文使用硅胶进行初步吸附/解吸附实验，发现其可增强抗原颗粒稳定性和完整性;进一步探究不同pH条件下的抗原颗粒稳定性，基于此，对硅胶实验中吸附与解吸附步骤进行优化，得到最佳的纯化方案;再与组合层析联用进一步纯化抗原，采用穿透式离子交换层析，保护抗原结构，提升层析纯化中抗原的活性收率。如下所述:
1、在硅胶对抗原颗粒稳定性和完整性分析研究中，对细胞破碎液进行硅胶处理，将洗脱液进行疏水层析纯化，颗粒完整性为85.79％，活性收率是49.73％。传统疏水层析方法的颗粒完整性为64.89％，活性收率为17.74％，两者相比较发现采用硅胶吸附/解吸附与疏水层析联用的纯化方法，颗粒完整性提高20.90％，抗原活性收率提高31.99％;将纯化后得到的抗原颗粒进行稳定性分析，发现经硅胶处理后，稳定性为57.60％，而传统疏水层析纯化抗原的稳定性为34.73％，相比较增加了22.93％;表明在疏水层析实验前加入硅胶纯化步骤有助于提升抗原颗粒的活性回收率和颗粒完整性，并且保持其稳定性。
2、在硅胶吸附/解吸附过程对HBsAg颗粒稳定性和完整性的影响研究中，首先利用单因素实验探究抗原浓度、吸附pH、吸附时间、解吸附pH、解吸附温度五种影响因素对活性收率以及蛋白收率的影响，并用高效液相凝胶过滤色谱(HPSEC)分析不同影响因素对抗原颗粒完整性的影响，结果表明:1g干硅胶对抗原的有效吸附量为47.85mg，小体系吸附实验仅需30min，达到吸附平衡，吸附pH在8左右，活性收率和蛋白收率较高，提高解吸附pH，活性收率和蛋白收率都会逐步上升，在pHIO左右最佳，而解吸附温度则是在55℃时，收率最佳。综合以上五种影响因素，HPSEC分析发现中大颗粒占比与活性收率呈现正相关的关系。同时利用静态光散射、荧光光谱和动态光散射等分析手段，从颗粒完整性角度研究抗原颗粒在不同pH条件下的稳定性变化，结果表明在酸性溶液中，pH接近HBsAg等电点时，抗原颗粒问静电斥力减小，颗粒容易聚集;碱性条件下，抗原颗粒内部疏水基团暴露，造成颗粒解聚。综合单因素实验结果以及静态光散射、荧光光谱和动态光散射结果分析，指导硅胶吸附/解吸附纯化HBsAg，建立该过程中关键因素的响应面模型，以活性回收率为响应值时，最佳纯化工艺为吸附pH=7.43，洗脱pH=10.48，洗脱温度55.4℃，此时活性收率最高为39.1％;以纯化倍数为响应值时，吸附pH=7.16，洗脱pH=10.52，洗脱温度55.1℃，此时纯化倍数最高为1.90。
3、探究出一条基于硅胶吸附和解吸附的组合层析法纯化HBsAg。初步探究疏水层析和离子交换层析对硅胶解吸附液的纯化效果，发现疏水层析具有载量大、核酸去除率高、产品纯度高特点，因此选择疏水层析作为组合层析第一步。在疏水层析实验中，首先对硅胶解吸附液进行pH和硫酸铵稳定性影响实验，发现硅胶解吸附液在pH7.5和6％硫酸铵条件下，活性保持最佳;并利用静态吸附实验考察丁基硫介质、丁基介质、低密度苯基介质、高密度苯基4种疏水层析介质对硅胶解吸附液的吸附和洗脱能力，发现疏水能力越强，蛋白越不容易洗脱，层析收率越低;利用动态实验对丁基硫疏水介质和丁基疏水介质进行柱实验纯化发现丁基硫疏水层析活性收率为54％，是丁基疏水层析的9倍;但是丁基硫疏水层析得到的洗脱液中，存在不完整组装的HBsAg颗粒，需要利用DEAE离子交换层析去除。在DEAE离子交换层析实验中，发现洗脱式得到的蛋白收率为4％，活性收率为45％，HBsAg收率低;提出穿透式纯化，发现活性收率提高51％,蛋白回收提高33％，最终得到一条硅胶—疏水层析—穿透式离子交换层析纯化HBsAg的路线，实现在提高疫苗收率的同时，去除不完整组装HBsAg颗粒的最终理想效果。纯化路线经初步放大，最终蛋白收率为3.94％，疫苗活性收率为40％，达到电泳纯(SDS-PAGE)和色谱纯(HPSEC)，经透射电镜观察到抗原颗粒粒径为20～40nm。