论文部分内容阅读
小麦白粉病是由白粉病菌（Ergsiphe graminis f.sp.tritici）引起的专性寄生真菌病害,在中国和世界小麦生产中危害日趋严重。由南京农业大学细胞遗传所发现的簇毛麦抗白粉病基因Pm21,对白粉病抗性强、抗谱广,已通过选育易位系途径导入普通小麦并被定位于6V染色体的短臂上。克隆Pm21基因并利用基因工程手段将其导入综合农艺性状优良的小麦品种中,对提高小麦白粉病抗性具有重要意义.本实验室在分离克隆抗白粉病基因研究中,已获得包括Pm21基因候选克隆在内的多个抗病相关基因。为了进一步鉴定这些抗病相关基因的抗性效应,本研究在优化小麦组织培养再生体系基础上,利用基因枪方法转化,将这些基因导入感病小麦品种,获得了一批转基因植株并对它们进行了分子检测和抗病性鉴定.为建立适于优良小麦品种遗传转化的高效组织培养体系,以20个优良小麦推广品种为试材,对以幼胚为外植体的愈伤诱导、分化和生根壮苗培养基进行筛选.试验结果表明,添加500mg/L水解酪蛋白、100mg/L脯氨酸、100mg/L谷氨酰胺,并以40g/L麦芽糖为碳源的MXD2培养基的出愈率最高,愈伤质量最好.以大量元素减半的1/2 MX为基本分化培养基,添加1mg/L ZT和0.5mg/L IAA对愈伤组织诱导分化的效果最好,分化率最高达到83.0%.以1/2 MX培养基中添加0.5mg/L IAA和0.5mg/L MET的生根效果最好,且移栽成活率高.不同基因型的组织培养特性差异显著,本研究筛选到扬麦158、南农9918、济麦20、宁麦9号等8个基因型可作为优良的转基因受体材料,并初步建立起适合于它们的植株再生体系。同时为拓宽小麦组织培养外植体的范围,对扬麦158的成熟胚和幼穗的再生培养体系也进行了有益的探索。分别以扬麦158的幼胚、幼穗、成熟胚为外植体,在诱导培养基中添加不同激素组合,观察它们对愈伤组织诱导率、直接发芽率、分化率和愈伤组织质量、重量、生长速率的影响,建立起适合不同外植体的植株再生体系。本研究构建了包括小麦类甜蛋白基因Ta-Tlp、小麦Mlo反义基因、簇毛麦谷胱甘肽还原酶基因Hv-GR和Pm21基因的候选克隆簇毛麦丝氨酸/苏氨酸激酶基因Hv-S/TPK等多个抗白粉病相关基因的植物高效表达载体。在表达载体中均采用来源于玉米泛素基因的单子叶植物高效启动子ubi为目标基因的启动子,除草剂抗性基因bar为植物选择标记。通过基因枪将其导入到小麦品种扬麦158的幼胚愈伤组织中,采用上述优化的再生培养方案,在含bialaphos的选择培养基上经两轮筛选和分化,分别获得了这些基因的除草剂抗性再生植株。通过对T0代再生植株进行PCR、Southern杂交与RT-PCR分析,获得转Ta-Tlp基因阳性植株27株,转小麦Mlo反义基因阳性植株45株,转Hv-GR阳性植株23株,转Hv-S/TPK阳性植株97株,平均转化率达到1.32%,转入的外源基因多数为多个拷贝。对T0代及其衍生的T1、T2代转化植株进行白粉病抗性鉴定,结果表明,Ta-Tlp基因超量表达的转基因植株,能延缓白粉病发病进程,但其T2代阳性转化植株的赤霉病抗性与受体对照无显著差异;部分转小麦Mlo反义基因的株系表现对白粉病中感到高抗;转Hv-GR基因植株的谷胱甘肽的氧化还原状态发生了改变,内源病程相关基因PR-la和PR-5被诱导表达,进而在一定程度上提高了转化植株对白粉病的抗性;值得注意的是转Hv-S/TPK基因的植株在整个生育期均表现高抗白粉病,叶片上仅有过敏性坏死斑和少量孢子堆出现。此外,还构建了包含Ta-LRR2基因的的植物表达载体pBI-LRR2,利用基因枪法将pBI-LRR2和携带bar基因的表达载体pAHC25共转化,以高感白粉病的小麦品种扬麦158幼胚愈伤为受体,对转化再生植株进行PCR、Southern杂交与RT-PCR等分子检测,获得转Ta-LRR2基因T0代阳性植株89株。对T0代和T1转化植株进行白粉病人工接种的抗性鉴定,转化植株苗期多数叶片仅有过敏性坏死斑出现,表现为高抗白粉病;灌浆期大部分阳性植株虽有不同程度的发病,但仅在倒三叶以下及基部叶片,表现中抗白粉病.同时在T1代筛选到了92株只有目标基因而无标记基因的转化植株,消除了标记基因带来的生物安全性疑虑,具有潜在的应用价值。