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第1章引言心肌梗死是猝死的主要原因。心肌梗死修复后期,由于心肌成纤维细胞异常活化,导致心脏发生以心肌肥厚和间质纤维化为特征的心室重构。研究表明,因心室重构而导致心力衰竭的患者5年内存活率小于35%。因此,如何及时预防心肌梗死修复期的心室重构和间质纤维化,是当前急性心肌梗死治疗面临的主要难题。而心肌纤维化是心肌梗死后重要的病理变化,心肌细胞过度纤维化会导致心室扩张,梗死区心肌膨大,心力衰竭,最终死亡。因此,寻找新型稳定可靠的心肌纤维化生物标志物,早期诊断心肌纤维化诊断,再深入研究其在心肌纤维化中的调控机制,有望提高缺血性心脏病整体治疗水平。MicroRNA是一种通过促进mRNA降解或抑制mRNA翻译来调控基因表达的负调节非编码RNA。在参与心肌纤维化的几种microRNA中,miR-21在多个脏器如肝、肾、肺的纤维化中起到了很大的作用。最近一项研究报道miR-21通过Smad7配体促进心肌梗死后心肌纤维化,这项研究发现由细胞转化生长因子-b1(TGF-b1)参与的信号通路是心肌梗死后心肌修复和纤维化的主要调节途径。心肌梗死后心肌成纤维细胞中TGF-b1明显上调,同时通过TGF-β1/Smad3信号通路促进心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化。鉴于miRNA作为靶向目标调节各种生理病理过程,我们假设miR-21可能以其他信号通路为靶目标参与心肌纤维化。有趣的是,在乳腺癌细胞中,Notch配体Jagged 1是miR-21的直接靶体。然而,miR-21和Notch信号通路在调节心肌纤维化中的联系机制并不清楚。因此,本研究旨在探讨miR-21是否通过Notch/Jagged1信号通路调节心肌纤维化。第2章miR-21促进TGF-β1诱导的心肌纤维化目的:探讨miR-21如何介导TGF-β1诱导心肌纤维化。通过构建用于抑制miR-21表达的腺病毒载体,探讨miR-21是否通过促进TGF-β1信号通路调节心肌纤维化。方法:用TGF-β1处理大鼠心脏成纤维细胞,观察抑制miR-21对TGF-β1的影响。用Western blotting和qPCR分析研究抑制miR-21介导TGF-β1后对各标志性蛋白的蛋白水平和RNA水平的影响。CCK-8和Transwell实验测定抑制miR-21对TGF-β1介导心肌纤维化细胞的增殖和侵袭的影响。结果:用TGF-β1处理CFB后miR-21表达明显增多,表明心肌纤维化诱导miR-21表达升高。CCK8实验表明降低心脏成纤维细胞miR-21活性,心脏成纤维细胞增殖能力受损;同时,降低miR-21活性,会抑制TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞增殖性能。Transwell实验表明降低心脏成纤维细胞miR-21活性,心脏成纤维细胞侵袭能力减弱;同时,降低miR-21活性,抑制TGF-β1诱导的心脏成纤维细胞侵袭性能。Western blotting和qPCR分别从蛋白水平和RNA水平分析了通过降低miR-21活性,抑制TGF-β1诱导的CMT。结论:miR-21促进TGF-β1诱导的心肌纤维化。抑制miR-21的表达可以明显改善心肌纤维化。且miR-21是通过促进TGF-β1的表达而加速纤维化的作用。第3章miR-21靶向作用于Jagged1,促进心肌纤维化目的:首先验证miR-21是否会和Jagged1靶向结合。再者验证miR-21通路作用于心肌纤维化是否通过Jagged1配体介导TGF-b1进行诱导的。方法:利用Luciferase实验验证miR-21是否会和Jagged1靶向结合。用Western blotting分析研究TGF-β1和miR-21抑制剂对大鼠CFs中肌成纤维细胞标志物蛋白水平的影响。用q PCR分析研究TGF-β1和miR-21抑制剂对大鼠CFs中肌成纤维细胞标志物m RNA水平的影响。CCK8和Transwell实验测定miR-21与TGF-b1和Jagged1之间的关系。结果:双荧光素酶报告基因实验验证miR-21靶向结合于Jagged1 3’-UTR。用抑制miR-21的腺病毒处理后,可以发现抑制miR-21活性后Jagged1表达明显增加。Western blotting和q PCR分别从蛋白水平和RNA水平验证了可以通过降低心脏成纤维细胞miR-21活性来消除TGF-β1对Jagged1的抑制作用。CCK8实验表明通过降低Jagged1表达,完全消除了miR-21对心脏成纤维细胞增殖性能的抑制。Transwell实验表明通过降低Jagged1表达,完全消除了miR-21对心脏成纤维细胞侵袭性能的抑制。Western blotting和q PCR分别从蛋白水平和RNA水平证明降低Jagged1表达后会完全抑制miR-21抑制剂对CMT的抑制作用。结论:miR-21可以靶向结合于Jagged1 3’-UTR。通过降低miR-21的活性来解除TGF-β1对Jagged1的抑制作用从而改善心肌纤维化。第4章体内验证miR-21促进心肌纤维化目的:探讨大鼠心力衰竭模型中miR-21如何靶向作用Jagged1通路从而促进心肌纤维化。方法:使用雄性SD大鼠在心耳下缘3-5mm LAD处用8-0的尼龙线进行结扎方法建立大鼠心力衰竭模型。Masson染色法检测心肌纤维化的程度。心脏超声检测miR-21靶向作用于Jagged1后对大鼠左心功能的影响。结果:心功能不全被miR-21抑制后得到改善,降低Jagged1后功能恶化。同时,在大鼠同时被miR-21抑制和降低Jagged1处理后,两者作用相互抵消。与对照相比,miR-21抑制组EF和FS都增加,左室舒张末期容积(LVEDV)和左心室收缩末期容积(LVESV)都减小,显著改善了心脏功能的恢复;但降低Jagged1后消除miR-21抑制的作用效果,左心功能恶化明显。Masson染色得出,心功能不全被miR-21抑制处理后得到改善,降低Jagged1后心功能恶化。同时,在大鼠同时被miR-21抑制和降低Jagged1处理后两者作用相互抵消。结论:miR-21在体内通过靶向作用于Jagged1配体促进心肌纤维化。