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研究背景与目的:骨肉瘤是儿童及青少年常见的原发性恶性骨肿瘤,60%-70%患者首发年龄为10-25岁,全球每年发病率为百万分之四。由于骨肉瘤高度的侵袭性,骨肉瘤患者术后易发生肿瘤复发和远隔脏器的转移。约10%-20%的患者在首次就诊时出现远隔脏器的转移,最常见是肺转移。同时,肺转移是骨肉瘤患者主要的死亡原因。一旦骨肉瘤患者发生转移及复发,往往预示着不理想的预后,5年生存率仅有20%-30%。目前,指南上推荐的治疗方式为术前新辅助化疗+肿瘤根治性切除术+术后化疗,该治疗方式被全世界广泛采用。随着多学科诊疗技术的发展,骨肉瘤患者的生存率相比上世纪70年代有了很大地提高,5年生存率达到50%-68%。尽管外科手术技术不断进步,为患者创造了骨肉瘤扩大切除的条件,但是肿瘤的耐药性是影响骨肉瘤患者预后的障碍。开发靶向药物,实现对骨肉瘤的精准治疗十分关键。因此,我们需要探究骨肉瘤发生、增殖、转移过程中的关键分子及通路,为骨肉瘤的靶向治疗提供新的药物靶点。Amphiphysin-1(AMPH-1)是一种128k D内吞蛋白,富含于神经末梢,参与网格蛋白介导的突触小泡内吞作用及神经元突触的生长。研究表明,AMPH-1在神经末梢突触小泡的循环中发挥重要作用。同时,AMPH-1在神经元中的低表达与神经元退变有关,参与阿尔茨海默病患者神经元淀粉样变性。AMPH-1的酵母同系物促进细胞周期转换,暗示AMPH-1可能在肿瘤的进展中发挥重要作用。近年来,AMPH-1被发现在肺癌及乳腺癌标本中低表达,并与患者预后不佳有关。研究发现,AMPH-1作为抑癌基因可以抑制肺癌及乳腺癌细胞体内外发生、增殖、迁移及转移过程。因此,AMPH-1可能是有效抑制恶性肿瘤发生、发展的关键基因。本研究旨在探讨以下几个问题:(1)探究AMPH-1在骨肉瘤样本中的表达水平及其与患者预后的关系;(2)明确AMPH-1在细胞水平及动物水平对骨肉瘤发生发展的调控;(3)AMPH-1在骨肉瘤内发挥作用的分子机制。研究方法:(1)在临床上收集骨肉瘤患者的肿瘤标本以及骨纤维结构不良患者的标本,通过免疫组化分析骨肉瘤组织及骨纤维结构不良组织中AMPH-1的表达情况,用Kaplan-Meier曲线明确AMPH-1的表达与骨肉瘤患者预后的关系,并通过卡方检验分析AMPH-1与骨肉瘤患者临床病理特征的关系;(2)通过构建AMPH-1稳定转染的细胞系,干扰骨肉瘤细胞中AMPH-1的表达,探究AMPH-1表达差异对骨肉瘤细胞增殖、凋亡等恶性肿瘤学行为的影响;(3)通过免疫印迹实验探究AMPH-1是否通过MEK/ERK信号通路调控骨肉瘤细胞的恶性肿瘤学功能;(4)通过构建裸鼠皮下荷瘤模型,探究敲低AMPH-1的骨肉瘤细胞在体内生长情况。研究结果:(1)免疫组化结果显示AMPH-1在骨肉瘤患者组织的表达下降,低表达AMPH-1的骨肉瘤患者的总生存期不佳。(2)敲低AMPH-1的骨肉瘤细胞增殖能力增强,细胞凋亡明显减少,G2期及S期细胞比例明显增加,G1期细胞比例明显减少;(3)敲低AMPH-1的骨肉瘤细胞中MEK及ERK表达水平升高;(4)通过皮下注射正常/敲低AMPH-1的骨肉瘤细胞构建裸鼠骨肉瘤模型,注射敲低AMPH-1的骨肉瘤细胞的小鼠骨肉瘤体积更大,重量更重。实验组肿瘤标本中磷酸化ERK表达量显著增加。研究结论AMPH-1在骨肉瘤组织中低表达,且低表达AMPH-1的患者预后较差。细胞实验证实敲低AMPH-1可以促进骨肉瘤细胞在体内外的发生发展。皮下注射敲低AMPH-1骨肉瘤细胞的裸鼠肿瘤体积更大,重量更重。在机制方面,我们明确了AMPH-1通过抑制MEK/ERK信号通路发挥作用,但是更加具体的机制需要进一步的实验验证。总之,我们的研究揭示了AMPH-1可以抑制骨肉瘤的发生和发展,有助于我们发现针对骨肉瘤靶向治疗的新靶点。