目的：　　 确定38株光滑假丝酵母菌临床分离株中唑类耐药株的耐药机制。　　 方法：　　 1.采用NCCLS2002年公布的M27-A2方案的微量稀释法测定5种常用抗真菌药物（两性霉素B、5-氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑）对38株光滑假丝酵母菌的MIC值。　　 2.采用MLST技术及REP-PCR技术用于光滑假丝酵母菌基因分型，MLST是扩增光滑假丝酵母菌6个管家基因内片段，扩增片段测序后与数据库数据比对得出每个基因的等位基因号，再根据6个等位基因号的组合得出每株菌的等位基因谱，即序列型，REP-PCR是扩增真菌基因组中的重复序列，通过电泳条带比较分析，揭示基因组间的差异，是一种基因组指纹分析方法。　　 3.采用real time RT-PCR方法检测CDR1，CDR2及SNQ2等外排泵基因在38株光滑假丝酵母菌的表达，采用罗丹明6G外排分析考察细胞膜外排泵功能，待测菌株在PBS中震荡培养2小时以耗竭葡萄糖，摄入罗丹明6G后，菌液分为两管，一管加入PBS，一管加入含葡萄糖PBS，15分钟后FACS分析细胞荧光强度。　　 4.采用real time RT-PCR方法检测ERG11基因在38株光滑假丝酵母菌的表达，PCR扩增ERG11基因全长并测序。　　 5.PCR扩增PDR1基因的两段，一段为中心调节区域，另一段为C-端激活区域，并测序，对于发现有PDR1基因突变的菌株，高保真酶扩增其PDR1基因全长，并克隆到高表达质粒载体pYES2/CT中，将pYES2/CT-PDR1质粒转化ATCC2001 ura3突变株(ATCC2001’)，观察转化成功的受体菌的纸片法药敏结果，real time RT-PCR检测其CDR1，CDR2，ERG11及SNQ2基因的表达，采用罗丹明6G外排分析考察其细胞膜外排泵功能，以证实PDR1基因突变与耐药的关系;real time RT-PCR方法检测PDR1基因在38株光滑假丝酵母菌的表达。　　 6.ATP检测试剂盒检测菌株ATP量，Pierce BCA蛋白检测试剂盒检测菌株蛋白含量，罗丹明123染色后FACS分析细胞线粒体膜电位，DCFH-DA染色后FACS检测菌株活性氧(ROS)的含量，线粒体透射电镜观察菌株线粒体数量及嵴的结构，观察YEPG平板上菌落生长情况，将5个浓度梯度的菌液点种至含不同呼吸抑制剂的GLC固体培养基上，观察菌株在含不同呼吸抑制剂的GLC固体培养基上药敏纸片的抑菌圈大小，观察菌株在有氧与无氧生长条件下药敏纸片的抑菌圈大小，观察呼吸抑制剂对膜电位和活性氧ROS的影响。　　 结果：　　 1.38株光滑假丝酵母菌中氟康唑耐药17株，伊曲康唑耐药12株，伏立康唑耐药7株。其中，7株伏立康唑耐药株同时对伊曲康唑、伏立康唑耐药，12株伊曲康唑耐药株均对氟康唑耐药，38株光滑假丝酵母菌对两性霉素B、5-氟胞嘧啶均敏感。　　 2.38株菌的REP-PCR和MLST两种分型方法的结果完全相同，REP-PCR的A，B，C，D，E型别分别对应于MLST的ST7，ST3，ST19，ST45和新型，38株菌中A型29株(76.3％)，B型5株(13.2％)，C型2株(5.3％)，D型、E型各1株(2.6％)，同一患者不同时期分离菌株的基因型相同。　　 3.耐药株与敏感株CDR1基因表达量差异有显著性(P=0.001)，耐药株与敏感株CDR2基因表达量差异无显著性(P=0.946)，但患者4分离到的3株耐药株4b，4c及4d其CDR2基因表达量分别为敏感株4a的2.75、4.14及3.7倍，耐药株与敏感株ERG11、SNQ2基因表达量差异无显著性(P=0.850)。耐药菌对罗丹明6G外排能力显著强于敏感菌(P=0.001)。　　 4.38株光滑假丝酵母菌ERG11未发现突变，耐药株与敏感株ERG11基因表达水平差异无显著性(P=0.283)。　　 5.17株氟康唑耐药株PDR1基因均分别发现一处有义突变，4d菌株PDR1基因连接载体转化ATCC2001’后，药敏纸片法显示对氟康唑耐药，CDR1基因表达量为ATCC2001’的20.53倍，CDR2基因表达量为ATCC2001’的4.03倍，罗丹明6G外排试验结果显示pYES2/CT-PDR1-ATCC2001’外排功能(荧光强度0.62)显著强于ATCC2001’(荧光强度4.25)，并提示pYES2/CT-PDR1-ATCC2001’呼吸代谢速度低于ATCC2001’。2株耐药株（11号、12号）及1株敏感株（17号）PDR1基因发生同义突变。耐药株PDR1基因表达量高于敏感株(P=0.012)。　　 6.敏感菌株每mg蛋白产生ATP量显著高于耐药菌株(P=0.001)，敏感菌株膜电位(P=0.001)及细胞内ROS量显著高于耐药菌株(P=0.000)，加入呼吸抑制剂NaN3后敏感菌株膜电位显著下降(P=0.000)，耐药菌株膜电位无变化或轻度下降。同一菌株厌氧条件下较有氧条件下更耐药。加入经典呼吸途径抑制剂NaN3，菌株生长更好，对药物敏感性降低，加入交替呼吸途径抑制剂SHAM后，菌株生长不良，对药物敏感性升高。电镜结果显示仅耐药的小菌落菌株可见线粒体异常，而耐药的正常大小菌落线粒体未见明显异常。由此可见，耐药菌株的呼吸代谢异常并非均由线粒体缺陷引起。　　 结论：　　 17株耐唑类药物光滑假丝酵母菌临床分离株的耐药机制与CDR1，CDR2等外排泵基因高表达(主要为CDR1)、外排泵功能强、PDR1基因突变、PDR1基因高表达、呼吸代谢异常等多因素有关。交替呼吸介导光滑假丝酵母菌耐药，但耐药菌株的呼吸代谢异常并非均由线粒体缺陷引起。