目的:慢性肾小球肾炎(chronic glomerulonephritis,CGN)是常见的临床免疫性疾病,临床主要症状是蛋白尿、血尿、水肿、高血压等症状。研究表明,炎性浸润和系膜细胞增殖是肾小球疾病的共同显著特征。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)是细胞中重要的信号转导通路,广泛参与细胞的增殖、分化、凋亡以及炎症的发生等过程,对CGN疾病的发生发展具有重要的调控作用。AS160是AKT的底物蛋白。PI3K诱导AKT的激活可以促使AS160和Rab14的GAP蛋白发生磷酸化,致使AS160将GDP水解为GTP的作用受到抑制,引起Rab14在吞噬体膜聚集,抑制自噬体成熟,最终抑制自噬活动,但在肾脏疾病的相关研究较少。自噬是一种维持细胞内稳态的胞内降解系统,参与调控多种肾脏疾病的发展。然而,尚不清楚肾小球系膜细胞的自噬是否可以抑制系膜细胞炎性增殖而对慢性肾小球肾炎产生保护作用。黄芪甲苷(AstragalosideⅣ,AS-IV)是黄芪干燥根的提取物,具有抗炎、抗病毒、抗氧化等作用。研究发现,AS-IV在各类肾脏疾病的治疗中具有较好的疗效,但在肾小球肾炎治疗中的研究还少见报道,其具体的药理机制还有待进一步研究。因此,本课题以PI3K/AKT/AS160及自噬为切入点,探讨在慢性肾小球肾炎中PI3K/AKT/AS160与自噬的内在联系及黄芪甲苷的干预作用。在体建立C-BSA慢性肾小球肾炎模型,观察AS-IV对CGN的治疗作用及可能机制;体外培养人系膜细胞(HMC),并用LPS刺激,观察AS-IV对系膜细胞增殖的调控作用,并进一步探讨ASIV治疗慢性肾小球肾炎的作用是否与调控PI3K/AKT/AS160/Rab14,影响自噬有关。方法:1.AS-IV对C-BSA肾炎大鼠的治疗作用及对PI3K/AKT/AS160-自噬的调控作用SD雄性大鼠60只,适应性喂养一周后,随机选择10只作为正常对照组,其余各组按照下述方法制备C-BSA肾炎模型:大鼠先进行预免疫,即称取1mg的C-BSA粉剂,溶于0.5ml的生理盐水加0.5ml弗氏不完全佐剂中进行对推,制备乳剂,对推时,水相推入油相。乳剂制备完成后,大鼠多点皮下注射,引起致敏免疫。预免疫一周后,第二周开始大鼠隔日尾静脉注射C-BSA溶液,每只注射剂量为2.5mg,持续4周。以大鼠24h尿蛋白含量作为评价模型成功的指标。造模成功后,大鼠随机分为模型组、贝那普利组、LY294002组、AS-IV低剂量组、AS-IV高剂量组。每天灌胃给予相应的药物或生理盐水,持续给药3周。(1)以大鼠24h尿蛋白,血液生化指标:血肌酐、尿素氮、超氧化物歧化酶、血液丙二醛、谷胱甘肽的含量;组织中IL-1β、IL-6的含量;肾组织病理形态学检测评价AS-IV的药效;以免疫荧光检测IgG、C3在肾小球的沉积;免疫组化检测Ki-67在肾组织的表达评价AS-IV对慢性肾小球肾炎的治疗作用。(2)使用Western-blot技术检测肾组织中PI3K、AKT、p-AKT、AS160、p-AS160、Rab14、Beclin1、LC3、p62、CyclinD1的表达水平;2.黄芪甲苷对系膜细胞的保护作用及对PI3K/AKT/AS160-自噬的调控作用体外培养的人系膜细胞,将分化成熟的HMC分为:空白组:加入完全培养基,模型组:加入30μg/ml的LPS;LY294002组:加入40ng/ml的LY294002和30μg/ml的LPS;AS-IV高:加入40μg/ml的AS-IV高和30μg/ml的LPS;AS-IV中:加入20μg/ml的AS-IV中和30μg/ml的LPS;AS-IV低:加入10μg/ml的AS-IV低和30μg/ml的LPS。(1)MTT检测细胞增殖活力,Anexin V/FITC试剂盒检测细胞凋亡情况;细胞周期检测试剂盒检测细胞周期;(2)免疫荧光检测细胞中LC3和p-AS160的表达情况;(3)Western-blot检测HMC中PI3K、AKT、p-AKT、AS160、p-AS160、Rab14、Beclin1、LC3II、p62、CyclinD1的表达情况。结果:1.AS-IV对C-BSA肾炎大鼠的治疗作用及对PI3K/AKT/AS160-自噬的调控作用(1)与C-BSA模型组相比,AS-IV可以改善C-BSA肾炎大鼠的精神状态,降低大鼠24h尿蛋白含量,降低BUN和SCr水平,减少血液中MDA含量,提高SOD水平,降低GSH含量。减低组织中IL-6和IL-1β的含量。肾组织染色结果显示黄芪甲苷还可以减轻肾组织损伤,减轻肾脏系膜区增殖,免疫组化结果显示黄芪甲苷可以减轻Ki-67的表达;减轻IgG、C3在肾小球的沉积;(2)Western-blot结果显示,C-BSA肾炎模型组,PI3K/AKT信号通路被激活,PI3K、磷酸化AKT、磷酸化AS160和Rab14的表达水平升高,CyclinD1的表达上升,自噬相关蛋白LC3、Beclin1的表达降低,p62表达升高。表明黄芪甲苷可以抑制PI3K/AKT/AS160/Rab14的活化,激活自噬。2.黄芪甲苷对系膜细胞的保护作用及对PI3K/AKT/AS160-自噬的调控作用(1)系膜细胞实验中,MTT实验结果表明,LPS可明显促进系膜细胞增殖,黄芪甲苷对系膜细胞的增殖具有抑制作用,PI3K抑制剂LY294002也可以明显抑制系膜细胞增殖;流式结果表明,AS-IV可以明显抑制LPS引起的系膜细胞增殖;Anexin V/FITC结果表明,LPS和AS-IV均不会引起系膜细胞凋亡;结果表明,黄芪甲苷可以抑制LPS引起的系膜细胞引起的系膜细胞炎性增殖,而对系膜细胞凋亡没有影响;(2)免疫荧光结果表明,与LPS模型组相比,黄芪甲苷可以抑制系膜细胞P-AS160表达,同时增加LC3的表达,表明,黄芪甲苷干预后,自噬活性增强。(3)Western-blot结果显示,与LPS模型组相比,黄芪甲苷可以抑制系膜细胞PI3K、磷酸化AKT、磷酸化AS160、Rab14的蛋白表达水平,提高自噬相关蛋白LC3Ⅱ、Beclin1的表达水平,降低p62表达水平;蛋白表达趋势与PI3K抑制剂LY294002组表达趋势相同。表明,黄芪甲苷可以抑制PI3K/AKT/AS160通路,从而抑制Rab14活性,增强系膜细胞自噬。结论:AS-IV对C-BSA肾炎具有较好的治疗效果,能够显著降低C-BSA肾炎大鼠24h尿蛋白,降低BUN和SCr水平,减少血液中MDA含量,提高SOD水平,降低GSH含量。减低组织中IL-6和IL-1β的含量,提高肾功能。AS-IV可以减轻肾组织病理损伤,抑制肾小球系膜区增殖情况;其机制可能是AS-IV可以通过抑制PI3K/AKT/AS160通路,抑制Rab14的活化,激活自噬,从而达到保护肾组织,改善肾功能的目的;AS-IV对体外培养的HMC具有很好的保护作用,可以抑制LPS引起的HMC炎性增殖。PI3K/AKT/AS160的活化可以激活Rab14,从而抑制系膜细胞自噬,黄芪甲苷可能通过抑制PI3K/AKT/AS160通路,抑制Rab14的活化,从而激活自噬达到改善系膜细胞增殖和炎症损伤的作用。