第一部分:生殖道细菌群落特征与机器学习诊断模型的探索研究研究背景与目的:女性生殖道作为一个富含微生物的器官,其主要为生态特点是以乳酸杆菌为主导的多细菌共生状态,少数健康人群也可出现非乳酸杆菌主导的为生态环境,其中部分细菌种类可能与生殖道炎症相关,而生殖道炎症与内异症的发生发展也有一定的关系。自人类微生物组计划发展以来,越来越多的研究都揭示了寄生于人类的细菌对于人类健康和疾病状态都有着密切的关系。通过近年来的研究,有相关研究报道了宫腔内细菌与内异症或原发性不孕相关,但由于方法学的局限性,该结论目前尚有争议。本研究旨在通过微生物组学和生物信息学分析方法结合,研究生殖道不同位点的微生物群落特征的差异性和不同疾病组间的细菌特征差异,为将来的生殖道细菌宿主机制的研究打下理论基础。研究方法:本研究为单中心、前瞻性、描述性、微生物组学及生物信息学研究。于中国医学科学院北京协和医院妇产科门诊和病房患者纳入受试者200例,患者最终诊断结果和信息通过手术记录和病历资料采集;19例通过影响学诊断确诊未手术治疗,181例通过手术治疗确诊。在受试者宫腔内、宫颈口和阴道后穹窿三点取样,其中宫腔内样本使用一次性无菌内膜真空吸管取样,后穹窿与宫颈口使用一次性阴拭子取样。通过PCR扩增和Illumina一代测序技术对样本内原核细菌的16S核糖体RNA进行高变区V3-V4区域测序,后续进行基因序列的拼接和过滤,通过RDP、Silva、GreenGene 13.5、KEGG等数据库比对进行物种识别。使用生物信息学方法对数据进行分析,找出特征性细菌和统计学差异物种。研究结果:使用随机森林算法在宫颈口区域对于内异症的阳性预测值为59.52%(25/42),阴性预测值为77.19%(44/57);在后穹窿区域对于内异症的阳性预测值为为32.65%(16/49),阴性预测值为89.80%(44/49)。宫腔内样本扩增成功5例,成功率仅为55.56%(5/9)。宫颈口与阴道后穹窿细菌特征未见显著差异性。对于痛经的随机森林预测中,阴道后穹窿的细菌特征贡献度较高并且均为正性贡献值;宫颈口细菌中负性贡献值较多。GnRHa是改变生殖道群落结构的主要影响因子。痛经、内异症或腺肌症相关的细菌中,所占比高较高且有显著统计学意义的有奇异菌属(Atopobium)、加德纳菌属(Gardnerella)、厌氧球菌属(Anaeroccoccus)、普氏菌属(Prevotella)等。研究结论:(1)痛经、不孕和内异症可能与细菌性阴道病相关细菌有关;痛经、内异症或腺肌症的发生发展可能与生殖道炎症相关,其具体致病机制需要未来进一步实验证实。(2)机器学习发现阴道后穹窿对于内异症疼痛有较高的阴性预测值。宫颈口比后穹窿距离宫腔较近,可能是对于内异症的阳性预测值更高的原因,后穹窿和宫颈管取样的便捷性和较高的扩增阳性率为将来大规模临床筛查提供了可能。(3)对于宫腔内细菌的扩增阳性率较低,受限于取样及扩增技术方法,目前对于宫腔内细菌并无统一认识,内膜取样方法学有待进一步完善。本研究提出了下生殖道细菌内毒素等致病因子逆行至宫腔导致内膜无菌性炎症引发内异症的假设。研究意义与展望:本研究使用了生物信息学分析方法和机器学习算法,通过微生物组学对于内异症等疾病进行了机器学习和预测,为将来的机器学习诊断内异症和相关妇科疾病进行了初步探索。首次使用了无菌真空吸管代替传统的内膜毛刷或阴拭子内膜取样,减少了样本污染的可能,为将来研究宫腔内细菌的方法学进行了初步探索。本研究的局限性在于仅通过生物信息学分析和机器学习进行研究,因此未来可通过细菌宿主交联机制与宏基因组学手段,对于细菌-炎症因子-疾病相关机制进行进一步的验证和研究。第二部分:子宫内膜异位症相关宫颈微生物群落特征的横断面研究研究背景与目的:子宫内膜异位症是好发于年轻育龄期女性的一种慢性疾病,对于生活质量和生育有着极大的影响。目前研究对于子宫内膜异位症的发病机制尚无确切定论,导致内异症相关症状的原因也亟待研究。相关研究提示内异症可能与免疫水平失调相关;而有关生殖道细菌的研究中,提示子宫内膜异位症的发病可能与生殖道炎症相关。针对内异症患者相关症状的多样性,本研究旨在使用16S-rRNA基因测序技术对内异症患者的微生物特征进行生物信息学分析,探索出内异症的微生物组学特征,从细菌学角度挖掘内异症潜在的致病机制。研究材料与研究方法:本研究为单中心、前瞻性、描述性、微生物组学及生物信息学研究。于中国医学科学院北京协和医院妇产科门诊和病房患者纳入确诊为内异症的受试者90例,患者最终诊断结果根据手术记录和病理报告确认为子宫内膜异位症诊断。在受试者宫颈口和阴道后穹窿两点使用一次性阴拭子取样,通过PCR和Illumina一代测序技术对样本内原核细菌的16S核糖体RNA进行高变区V3-V4区域测序,可用样本共177例。后续进行基因序列的拼接和过滤,通过RDP、Silva、GreenGene 13.5、KEGG、Bugbase等数据库比对进行物种识别。使用生物信息学方法对数据进行分析,找出特征性细菌和统计学差异物种,挖掘预测细菌功能、表型与症状间的关系。研究结果:(1)奇异菌属和加德纳菌等阴道炎相关细菌属在不孕患者中显著增高,乳酸杆菌在不孕患者中显著降低;两组患者菌群结构经Beta多样性分析有显著差异性;乳酸杆菌属可作为评估患者不孕与否的一个细菌标识;不孕组患者加德纳菌的厌氧菌、生物膜和氧化应激基因表型频率相对较高。(2)加德纳菌属在痛经组中显著升高并且可以作为生物标识;Sneathia和噬冻菌属在痛经患者中显著降低。痛经组中的厌氧菌、生物膜与格兰阴性菌基因表型频率较高。(3)GnRHa治疗组患者与未治疗患者的菌群结构差异较大,治疗组患者中乳酸杆菌含量有显著降低,同时埃希菌属与厌氧球菌属在治疗组中都显著增高(p<0.05),并且与衰老、外分泌系统、免疫系统和肿瘤等功能有关。(4)r-AFS高分期患者相对厌氧菌、生物膜、革兰阳性、潜在致病菌和氧化应激耐受表型相对较高,不同分期的内异症患者菌群结构未显示出较大差异性。研究结论:内异症患者的症状差异性可能与生殖道细菌群落的结构差异和功能差异性相关,不孕、痛经等症状与炎症相关细菌增多伴乳酸杆菌减少有关,其机制可能与炎症因子的改变有关,未来针对炎症反应与抗菌治疗可能是缓解内异症不孕与痛经的方法。内异症相关的痛经与不孕症状与内异症相关的微生物组学研究应将炎症反应与炎症相关细菌(内毒素)纳入研究范畴共同研究。乳酸杆菌与阴道炎症相关细菌导致的细菌-宿主交联机制与免疫系统的变化是未来内异症微生物组学的研究方向。研究意义与展望:本研究首次通过16S-rRNA测序和生物学信息分析方法对于内异症患者不同临床特点进行微生物组学研究,提出生殖道炎症通过炎症因子导致内异症疼痛与不孕等症状发生的理论假设。通过微生物的特征和功能预测,为将来内异症的精准诊治和研究提供了新的思路和理论依据。从微生物组学角度增加且完善了子宫内膜异位症“在位内膜决定论“的理论认识。”