【摘 要】
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2’-岩藻糖基乳糖（2’-Fucosyllactose,2’-FL）是母乳寡糖中含量最高的成分,具备很多的生理功能。除了维护婴幼儿的肠道健康,在婴幼儿免疫系统的建立与调节以及大脑神经系统的发育中也发挥着重要的作用。由于其在婴幼儿食品和医药行业的应用价值,获得了广泛的关注。目前,2’-岩藻糖基乳糖主要通过化学法、酶法或全细胞发酵法合成。但传统的化学合成法,存在着步骤繁琐,得率低等问题;酶法合成一般需
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2’-岩藻糖基乳糖（2’-Fucosyllactose,2’-FL）是母乳寡糖中含量最高的成分,具备很多的生理功能。除了维护婴幼儿的肠道健康,在婴幼儿免疫系统的建立与调节以及大脑神经系统的发育中也发挥着重要的作用。由于其在婴幼儿食品和医药行业的应用价值,获得了广泛的关注。目前,2’-岩藻糖基乳糖主要通过化学法、酶法或全细胞发酵法合成。但传统的化学合成法,存在着步骤繁琐,得率低等问题;酶法合成一般需要昂贵的糖基化合物作为原料,成本较高。全细胞发酵法以大肠杆菌等微生物作为发酵菌株,利用较廉价的原料作为发酵底物,为实现2’-FL的商业化生产提供了更多的可能性。本研究以大肠杆菌BL21（DE3）作为出发菌株,构建鸟苷-5’-二磷酸（GDP）-岩藻糖和2’-FL的代谢合成途径,通过失活支路途径基因,同时优化合成途径基因的表达,提升宿主菌株生产2’-FL的能力。并对摇瓶发酵条件进行优化,通过补料发酵实验,进一步提高2’-FL的产量。主要研究内容如下:（1）首先为提高胞内GDP-岩藻糖的积累量,比较了从头合成途径和补救合成途径生产GDP-岩藻糖的差异,构建GDP-岩藻糖的生产菌株21-bcgw（含质粒p AC-BCGW）、21-fkp（含质粒p ET-F）和21-bcgw F（含质粒p AC-BCGW和p ET-F）,发酵结果显示组合两种途径的菌株21-bcgw F所生产的GDP-岩藻糖的产量最高,是21-bcgw和21-fkp的2倍和1.48倍。（2）在此基础上将编码α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因fuc T2克隆到质粒p ET-F中,并将质粒p AC-BCGW和p ET-FF共同转入大肠杆菌BL21（DE3）中,构建2’-FL生产菌株Strain1。SDS-PAGE蛋白电泳结果表明从头合成途径的磷酸甘露糖突变酶（Man B）、甘露糖-1-磷酸鸟苷转移酶（Man C）、GDP-D-甘露糖-4,6-脱水酶（Gmd）、GDP-L-岩藻糖合酶（Wca G）和来自于补救合成途径的岩藻糖激酶/岩藻糖-1-磷酸鸟苷基转移酶（Fkp）以及α-1,2-岩藻糖基转移酶（Fuc T2）都已成功在菌体内表达,且Strain1菌株经过70 h发酵生产了0.22 g/L 2’-FL。（3）随后利用CRISPR-Cas9技术敲除宿主菌株的β-半乳糖苷酶（Lac Z）、UDP-葡萄糖脂质载体转移酶（Wca J）、岩藻糖异构酶（Fuc I）和岩藻糖激酶（Fuc K）,分别获得了基因编辑菌株BW（Δwca J）、BWL（Δwca J/Δlac Z）和BWLF（Δwca J/Δlac Z/Δfuc IK）。将构建的质粒p AC-BCGW和p ET-FF同时导入以上三种敲除宿主中,构建发酵菌株BW1、BWL1和BWLF1。发酵结果显示敲除四个基因的BWLF1菌株所生产的2’-FL产量最高,是原始菌株的10.36倍;敲除lac Z基因的BWL1菌株乳糖的转化率提高至36%,是BW1菌株的14.7倍;而BWLF1菌株相比于BWL1菌株,乳糖转化率又提高了19%。（4）以BWLF缺陷型菌株作为宿主,利用模块化策略,将来源于从头合成途径的基因man C、man B、gmd和wca G放置于一个模块,来源于补救合成途径的基因fkp以及α-1,2-岩藻糖基转移酶的基因fuc T2放置于第二个模块,采用双质粒组合形式构建2’-FL生产菌株,并通过变化质粒的拷贝数调节途径基因的表达水平。发酵结果显示表达中拷贝数质粒p CD-BCGW和高拷贝数质粒p ET-FF的BWLF3菌株所生产的2’-FL的产量最高,相较于BWLF1（表达质粒p AC-BCGW和p ET-FF）菌株,产量提高了10%。（5）最后以BWLF3作为出发菌株,对摇瓶发酵条件:IPTG浓度、诱导温度、诱导时间以及碳源进行优化,优化后的发酵条件为:诱导温度为37°C,添加诱导剂IPTG终浓度为0.2 mmol/L,最适诱导时间为菌株长至OD600为1.2,以甘油作为碳源,最终2’-FL的摇瓶发酵产量为2.62 g/L。随后在3 L发酵罐中进行补料发酵,经过补料发酵,2’-FL的产量提高至14.1 g/L。
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