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毛细管电泳(CE)是一种高灵敏、高分辨、高速度、低样品消耗的微分离分析技术,已在生物、医学、制药、环境卫生、食品等方面得到了深入的应用,尤其是在生命科学领域。而蛋白组科学是现今生命科学研究中的重点之一,其中,酶活性研究更是研究者们关注的热点前沿。许多重要疾病的发生发展与酶的异常活动密切相关。
Caspase是一类死亡特异性蛋白酶家族,可通过两种基本的途径——线粒体途径和死亡受体途径,介导细胞凋亡。其中Caspase-3是两条凋亡途径的汇合点。而Caspase-2在凋亡中的作用一直都存在很大的争议。本文用CE监测了细胞凋亡过程中Caspase-3和Caspase-2的活化过程,且Caspase-2的催化速度与Caspase-3相比有明显的突跃,为抗肿瘤药物筛选与评价提供了一种全新的方法。
为了监测细胞凋亡过程中蛋白酶Caspase-3的活化过程,作者采用了一种融合荧光蛋白探针(ECFP-DEVD-DsRed)作为Caspase-3的底物。用荧光共振能量转移分子成像方法证明了此融合荧光蛋白在HeLa细胞质内表达的稳定性与可靠性。当用一定剂量的顺铂诱导HeLa细胞时,凋亡发生,Caspase-3被激活,其荧光底物被酶切成两部分。用CE在体外分析了一系列不同诱导时间的HeLa细胞裂解液,定量描述了凋亡过程中Caspase-3的活化过程。为获得满意的分析结果,我们优化了CE分离条件,如缓冲液类型、pH值、浓度和分离电压。由于二元荧光蛋白探针的使用,强化了产物与底物之间的差异,使CE分离更容易,并且能够进一步验证实验结果的可靠性。
同样,为了监测细胞凋亡过程中蛋白酶Caspase-2的活化过程,作者采用了另外一种融合荧光蛋白探针(ECFP-VDVAD-DsRed)作为Caspase-2的底物。当用一定剂量的顺铂诱导HeLa细胞时,凋亡被启动,Caspase-2被激活,其荧光底物被酶切成两部分。通过CE分析一系列不同诱导时间的HeLa细胞裂解液,得出凋亡过程中Caspase-2的活化特性曲线。最后对单个HeLa细胞凋亡过程进行了荧光分子成像,与CE分析群体细胞方法进行了对比。