胆囊结石病是由于胆囊胆汁生化学失衡引发的临床疾病,80%以上为胆固醇结石病(CGD)。目前公认的CGD治疗方法是胆囊切除术,但该种治疗方法具有创伤性,存在发生胆管损伤等严重并发症的风险,治疗费用较高。因此,更加透彻地认识CGD的发病机制,寻找有效的、无创的预防和治疗CGD的方法越来越必要。关于CGD发病机制的研究已从Admirand和Small基于热力学的生物化学理论解释转移到多种因素综合作用的学说,如胆固醇过量分泌及所伴随的胆汁非生理性过饱和、胆囊的运动功能下降及所伴随的胆汁淤积、胆汁中胆固醇结晶形成及促成核因子和抗成核因子作用的失衡等,而且与CGD发病有关的脏器研究也扩展到肝脏、胆囊和肠道。虽然CGD这种受环境和遗传因素交互影响的多因素疾病的发病机制迄今还不十分明晰,但公认的是胆汁中胆固醇的非生理性过饱和是CGD发病的标志性病理生理改变。然而,胆汁胆固醇的过量分泌、小肠胆固醇的吸收、胆固醇的逆向转运和体内胆固醇的合成这些胆固醇代谢过程中的重要环节在CGD发病中的作用和相互影响机制还有许多研究的空白领域。研究表明肠腔中饮食来源和胆汁来源的胆固醇的获得和小肠固醇吸收的效能与结石易感群体的成石状态密切相关,因此抑制了胆固醇小肠吸收这一过程就可能对CGD的预防和治疗起到有益作用。依折麦布(EZET)是美国先灵葆雅公司新近研发并获得美国FDA批准上市的一种口服、强效的降脂药物。EZET选择性抑制小肠粘膜细胞刷状缘对胆固醇的摄取和吸收,将胆固醇限制在肠腔内随粪便排出体外,从而降低血循环中胆固醇的水平,进而降低小肠中的胆固醇向肝脏中的转运。已经证实Niemann-Pick C1 like1蛋白(npc111)是EZET的作用靶点。本研究旨在建立致石饮食诱发的C57BL／6鼠胆囊胆固醇结石动物模型,并在此基础上观察EZET对致石饮食诱发的C57BL／6鼠胆囊胆固醇结石形成、胆囊运动功能和肝脏脂质代谢的影响。实验方法一、动物模型的建立雄性C57BL／6鼠,8-10周龄,体质量11-16g,对照组(20只)饲以普通饲料(胆固醇含量0.02%(wt/wt));致石组(20只)饲以高胆固醇／高脂肪／胆酸致石饲料(含2%胆固醇、0.5%胆酸和15%脂肪)。喂饲8周后取材。二、实验对象分组和给药1、EZET对胆囊胆固醇结石形成影响实验随机分为4组：(1)致石饮食+蒸馏水组(EZET-0):20只；(2)致石饮食+EZET(1mg/kg/d)组(EZET-1):20只；(3)致石饮食+EZET(5mg/kg/d)组(EZET-2):20只；(4)致石饮食+EZET(10mg/kg/d)组(EZET-3):20只。2、EZET对胆囊运动功能影响实验随机分为5组：(1)普通饮食+蒸馏水组(CON)：5只；(2)致石饮食+蒸馏水组(EZET-0):5只;(3)致石饮食+EZET(1mg/kg/d)组(EZET-1):5只;(4)致石饮食+EZET(5mg/kg/d)组(EZET-2):5只；(5)致石饮食+EZET(10mg/kg/d)组(EZET-3):5只。3、EZET对肝脏脂质代谢影响实验随机分为3组：(1)普通饮食+蒸馏水组(CON)：20只；(2)致石饮食+蒸馏水组(LITH):20只；(3)致石饮食+EZET(5mg/kg/d)组(EZET):20只。三、标本采集和实验方法1、10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,取腹部正中切口,记录成石情况,测量胆囊长径和宽径,收集胆囊胆汁,胆总管置PE管收集肝胆汁并计量,切取胆囊组织、全部肝脏(称重)、空肠起始段1cm,下腔静脉穿刺取血。2、按椭圆形公式计算胆囊体积,计算肝胆汁分泌速率。3、红外光谱溴化钾压片法,对采集的结石成分进行定性分析。4、胆囊胆汁涂片后于偏光显微镜下观察。5、采用全自动生化分析仪检测胆汁中胆固醇、磷脂和胆汁酸的浓度并计算胆固醇饱和指数(CSI)。6、透射电镜下观察肝脏细胞超微结构。7、颈静脉置管后以17nmol/Kg体重给予外源性CCK-8,收集每10min肝胆汁计量统计。8、胆囊组织HE染色和饱和苦味酸-天狼猩红染色,光镜下和偏光显微镜下观察组织学改变和胆囊壁胶原沉积。9、采用全自动生化分析仪检测血清中胆固醇、甘油三酯、胆汁酸和谷丙转氨酶的含量。10、肝脏组织油红O染色,光镜下观察肝脏脂质沉积情况。11、肝脏组织HE染色和脂肪浸润评分。12、采用Western blot方法检测肝脏组织主要肝胆转运蛋白abcb11、abcg5、abcg8和abcb4蛋白的表达；检测空肠粘膜上皮npc111蛋白的表达。实验结果一、C57BL／6鼠胆囊胆固醇结石动物模型的建立肉眼观察：对照组小鼠成石率为0(0／19)。致石组成石率为100%(18／18)。结石经溴化钾压片红外光谱检测证实为胆固醇结石。对照组小鼠胆囊体积为(22.6±8.35)μl,致石组胆囊体积为(63.2±10.6)μl,二者相比具有统计学差异(t=12.98,p<0.01)。对照组小鼠肝胆汁的分泌速率为(1.12±0.06)μl/min/g liver,致石组为(1.32±0.07)μl/min/g liver,二者相比具有统计学差异(t=6.66,P<0.01)。偏光显微镜下观察：对照组小鼠胆囊胆汁内未见胆固醇结晶,致石组可见胆固醇—水合物结晶、晶体和结石。对照组胆囊胆汁中胆固醇的浓度为5.79 mmol/L,致石组为18.67 mmol/L,远高于对照组；对照组胆囊胆汁中磷脂的浓度为29.69 mmol/L,致石组为28.99mmol/L,两组数值接近；对照组胆囊胆汁中胆汁酸的浓度为154.46 mmol/L,致石组为138.69 mmol/L,较对照组略低；致石组胆囊胆汁中CSI明显高于对照组(1.71vs 0.58),致石组CSI>1,为胆固醇过饱和胆汁。透射电镜下观察：致石组与对照组相比小鼠肝细胞内出现大量小泡形脂滴,并呈现肝细胞损伤的改变。二.EZET预防致石饮食诱导的C57BL／6鼠胆囊胆固醇结石的形成EZET-0组成石率为100％(18/18)。EZET-1组成石率44.4%(8／18)。EZET-2组成石率为10.5%(2／19)。EZET-3组成石率为0(0／17)。偏光显微镜下观察,EZET-0组小鼠胆囊胆汁内多见真结石。EZET-1组小鼠胆囊胆汁内多见不完整的未定型的泥沙样结石边缘有散在的胆固醇—水合物结晶突出或胆固醇晶体形成。EZET-2组小鼠胆囊胆汁内多见散在胆固醇结晶。EZET-3组小鼠胆囊胆汁内未见胆固醇结晶。EZET-0组肝胆汁的分泌速率为(1.32±0.07)μl/min/g liver；EZET-1组肝胆汁的分泌速率为(1.43±0.05)μl/min/g liver；EZET-2组肝胆汁的分泌速率为(1.53±0.12)μl/min/g liver；EZET-3组肝胆汁的分泌速率为(1.73±0.08)μl/min/g liver,各组相比具有统计学差异(P<0.05)。EZET-0组胆囊胆汁中胆固醇的浓度为18.67 mmol/L:EZET-1组为12.43mmol/L:EZET-2组为9.65 mmol/L;EZET-3组为4.42 mmol/L,逐渐下降。EZET-0组胆囊胆汁中磷脂的浓度为28.99 mmol/L;EZET-1组为28.23 mmol/L;EZET-2组为30.14 mmol/L;EZET-3组为33.82 mmol/L,数值接近。EZET-0组胆囊胆汁中胆汁酸的浓度为138.69 mmol/L;EZET-1组为138.26 mmol/L:EZET-2组为145.98mmol/L;EZET-3组为169.21 mmol/L,有逐渐增加趋势。EZET-0组胆管胆汁中胆固醇的浓度为(4.67±0.28) mmol/L;EZET-1组为(3.17±0.41)mmol/L;EZET-2组为(2.25±0.51)mmol/L;EZET-3组为(1.76±0.38)mmol/L,依次显著下降。EZET-0组胆管胆汁中磷脂的浓度为(8.26±0.45)mmol/L; EZET-1组为(7.25±0.46) mmol/L;EZET-2组为(5.63±0.62) mmol/L;EZET-3组为(5.18±0.95) mmol/L。EZET-0组胆管胆汁中胆汁酸的浓度为(24.67±1.01)mmol/L;EZET-1组为(24.17±1.08)mmol/L;EZET-2组为(23.44±1.63)mmol/L:EZET-3组为(23.39±1.47) mmol/L。Western blot结果显示,EZET-0组小鼠空肠粘膜上皮npclll蛋白表达水平最高,随着EZET给药量的增大,npclll蛋白表达水平逐渐下降。三、EZET改善了致石饮食诱导的胆囊胆固醇结石病C57BL／6鼠胆囊运动功能CON组胆囊体积为(22.02±4.35)μl。EZET-0组胆囊体积为(62.76±8.11)μl,EZET-1组胆囊体积为(48.84±7.66)μl, EZET-2组胆囊体积为(34.74±5.96)μl,EZET-3组胆囊体积为(23.84±5.76)μl,各组均显著低于EZET-0组(p<0.05)。CCK-8干预实验结果显示：EZET可以明显提高小鼠对CCK-8的反应性,并且随着EZET剂量的增大,胆汁流量曲线下面积逐渐增大,提示胆汁分泌量明显增加。镜下观察发现：与CON组相比,EZET-0组小鼠胆囊组织出现显著的粘膜增生和固有层结缔组织的扩张,出现显著的胶原沉积；EZET-1、EZET-2和EZET-3组小鼠胆囊组织的上述改变较EZET-0组稍轻但不明显。四、EZET减轻了致石饮食诱导的胆囊胆固醇结石病C57BL／6鼠肝脏的脂质沉积肝脏的组织学观察和油红O染色观察发现：EZET明显减轻了致石饮食诱导的小鼠肝脏的脂肪沉积和损伤改变。EZET显著降低了肝脏脂肪浸润评分。EZET显著降低了致石饮食诱导的血中胆固醇水平的升高；显著降低了致石饮食诱导的血中胆汁酸水平的升高；同时显著降低了致石饮食诱导的血中谷丙转氨酶水平的升高；但对血中甘油三酯水平无影响。Western blot结果显示：致石饮食并未显著影响胆酸转运子abcbll蛋白的表达,然而,EZET组的abcbll的表达水平较LITH组升高,提示EZET干预后abcbll蛋白的表达上调；研究还发现致石饮食显著增加了胆固醇转运蛋白abcg5和abcg8蛋白的表达,但EZET并没有显著改变abcg5和abcg8蛋白的表达；研究发现致石饮食并未显著影响磷脂转运子abcb4蛋白的表达,同时EZET也没有显著改变abcb4蛋白的表达。1、高脂饮食诱导的C57BL／6小鼠胆囊胆固醇结石动物模型经济可靠,成模率高,可用于胆囊胆固醇结石病的动物实验研究。该模型建立的病理生理基础是高脂饮食诱导的胆汁中胆固醇的非生理性过饱和。2、EZET对高脂饮食诱导的C57BL／6小鼠胆囊胆固醇结石形成具有预防作用,其机制是通过EZET降低胆囊胆固醇结石C57BL／6小鼠胆汁中胆固醇的非生理性过饱和实现的。EZET可能是通过降低小鼠空肠粘膜上皮刷状缘npc111蛋白的表达进而减少肠道胆固醇的吸收而实现上述作用的。3、EZET对致石饮食诱导的胆囊胆固醇结石C57BL／6小鼠的胆囊运动功能具有保护作用。4、EZET能够明显减轻致石饮食诱导的胆囊胆固醇结石C57BL／6鼠肝脏的脂肪沉积和损伤。EZET能够增加致石饮食诱导的胆囊胆固醇结石C57BL／6小鼠肝脏胆汁酸转运蛋白abcb11的表达,但对胆固醇转运蛋白abcg5、abcg8和磷脂转运蛋白abcb4的表达无影响。