河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)为我国特有的小型淡水底栖肉食性经济鱼类,目前对河川沙塘鳢的研究主要集中在选育种和养殖等方面,对其免疫相关基因和抗病因子研究未见报道。因此,开展河川沙塘鳢的免疫相关基因(因子)研究,初步了解其免疫应答机制,对河川沙塘鳢病害防治和开辟河川沙塘鳢抗病育种新途径具有重要意义。本研究以河川沙塘鳢为研究对象,采用RACE、实时荧光定量PCR等技术,对该鱼的MHCⅡA、MHCⅡB、MyD88和TLR2 4个基因进行了克隆和表达模式分析。主要研究结果如下:1、获得了河川沙塘鳢MHCⅡA、MHCⅡB、MyD88和TLR2基因的全长cDNA序列,分别为884bp、896bp、1445bp和3473bp;预测其包括开放阅读框(ORF)分别为 711bp、726bp、726bp 和 2631bp,分别编码 236、241、288 和 876 个氨基酸;其 5’UTR分别为 19bp、20bp、31bp 和 75bp,3’UTR 分别为 154bp、150bp、557bp 和 767bp。4个基因的3’UTR均有脊椎动物典型的加尾信号AATAAA,以及分别具有32bp、28bp、26bp 和 30bp 的 PolyA 尾巴。2、经生物学信息分析表明,MHCⅡA和MHCⅡB编码的两条多肽链都包含1个信号肽、2个胞外结构域(α-1和α-2,β-1和β-2)、1个跨膜区和1个胞质区,这与典型的MHCⅡ类基因结构相同;在结构上具有保守的半胱氨酸残基、丰富的磷酸化位点等。同时对MHCⅡA和MHCⅡB空间结构进行预测,结果表明,河川沙塘鳢MHCⅡA和MHCⅡB基因皆具有经典的MHCⅡ空间结构,说明MHCⅡA和MHCⅡB是MHC家族基因。MyD88基因N端和C端分别存在死亡结构域和TIR结构域,在这两个结构域中存在多个功能位点。TLR2基因存在LRR基序和TIR结构域,符合TLR家族所具备的重要特征;TLR2蛋白分子也存在多个功能位点。3、通过序列比对分析显示河川沙塘鳢MHCⅡ、MHCⅡB、MyD88和TLR2氨基酸序列与其他鱼类的同源性分别为42-52%、37-52%、43-61%和48-63%,而与其他脊椎动物相比,同源性较低。根据MHCⅡA、MHCⅡB、MyD88和TLR2基因氨基酸序列构建了系统进化树,结果显示河川沙塘鳢与鲈形目的鱼类亲缘关系较近。4、通过RT-PCR检测MHCⅡA、MHCⅡB、MyD88和TLR2基因在健康河川沙塘鳢12种组织中的分布规律,结果显示4个基因在其肝、血液、肾、肠、鳃、心脏、脾、脑、性腺、肌肉、胃及鳔12种组织中均有表达,但是4个基因在各组织表达量有所不同。MHCⅡA基因在脾、肠、鳃中表达量高,MHCⅡB基因在肾、肠、血液中表达量较高,MyD88在肝、肾、鳃、血液中表达很高,TLR2在肝、肾、肠、血液和胃中都有较高的表达水平,4个基因在剩余其他组织表达程度中等或表达极低,这说明4个基因在河川沙塘鳢免疫器官和组织中高表达。5、对健康河川沙塘鳢进行人工感染嗜水气单胞菌后,通过qRT-PCR对其3种主要免疫组织(肝、脾、肾)中4个基因在不同感染时段(0、4、24、48、72和96h)的表达量进行检测,结果表明,3种组织中MHCⅡA、MHCⅡB、MyD88和TLR2基因的mRNA水平均发生了不同程度的变化。MHCⅡA基因在3种主要免疫组织中的表达随感染时间不同而发生波动,且变化趋势比较一致。MHCⅡB基因在脾和肝中表达水平呈现先上升后下降再上升的模式,肾中MHCⅡB基因表达则是先下降再上升,在24h时表达最低。MyD88基因在脾和肝组织中的表达趋势一致,感染后4-96h表达量均高出感染前,而在肾组织中,感染后4-24h表达量发生轻微下降,之后上升且维持在较高水平。而TLR2基因在肝、脾、肾3种组织中不同时段的表达量也呈现不同的表达水平。由此证明这4个基因参与了机体对细菌感染的免疫应答。