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猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)、母猪繁殖障碍(Sow abortion and mortalitysyndrome,SAMS)、猪皮肤肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)、呼吸道综合征等相关疾病的重要病原。PCV2是一种免疫抑制性病毒,损害感染猪的免疫功能,引起继发或合并感染,造成的损失难以估计,PCV2已经成为严重制约我国养猪业的重要病原之一。由于病毒经常以亚临床感染的形式出现,常易被忽视,因此应当进一步加强对PCV2感染的流行病学及分子生物学的研究。PCV2的ORF2基因编码病毒的主要结构蛋白,此蛋白具有良好的免疫原性,基因序列保守,可用于临床诊断。本试验设计一对PCV2型特异性引物,从保定周边3个规模化猪场采集17份疑似PMWS的病料中提取病毒核酸,用PCR方法扩增含有EcoRⅠ酶切位点的PCV2型特异片段,酶切鉴定后证实有16份病料中有PCV2存在,表明保定周边猪场中已广泛存在PCV2感染。从3个猪场分别选取1份PCR检测阳性病料,经处理后接种无污染的PK15细胞,盲传6代后,用扩增全基因组的引物P3/P4,采用PCR方法扩增病毒的全基因组检测细胞分离病毒的效果;回收扩增全基因组的PCR产物,克隆到pMD19-T载体中,经序列测定、PCR及SacⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后,获得3株分离毒的阳性克隆株,分别命名为HBa株、HBb株、HBc株。通过多序列比对和遗传进化树分析,证实3个分离株之间的核苷酸同源性在98.4%～99.6%,分离株HBb、HBc之间的只相差8个碱基,具有很高的同源性。遗传进化树分析证实了本试验分离毒与GeneBank中(2007～2008)登陆的PCV2毒株之间不存在地理位置上的相关性。3株毒的成功分离为本地区规模化猪场有效的诊断防治猪圆环病毒病提供了科学依据,丰富了本地区PCV2感染的流行病学资料。根据分离株HBa基因组序列,设计一对引物P5/P6,以重组质粒pM019-T-PCV2质粒为模板,对PCV2的ORF2基因进行扩增,扩增片段包含完整的ORF2阅读框,大小为721bp。将扩增ORF2基因片段插入到载体pMD19-T中,经PCR、SacⅠ和HindⅢ双酶切鉴定为HBa分离株的ORF2基因。利用DNAStar软件对ORF2基因序列及编码蛋白的氨基酸序列进行分析发现:该基因N端含有许多串联或单联的稀有密码子,而稀有密码子的使用频率影响基因的表达;ORF2编码蛋白的抗原表位主要位于C端,所以根据克隆的ORF2基因序列,用引物P7/P6扩增ORF2基因后部约600bp的基因片段,克隆到融合表达载体pET-32a中。经PCR及酶切鉴定后将阳性重组子转入大肠杆菌BL21(DE3)中,进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳和Western-blotting分析,结果表明,重组表达质粒在大肠中所表达的融合蛋白相对分子量为40kDa,Western-blotting分析表明该蛋白能被PCV2阳性血清识别。融合蛋白的成功表达为PCV2感染的临床诊断和PCV2抗体检测方法的建立奠定了基础。