论文部分内容阅读
自然环境中的微生物资源极其丰富。然而,只有不到1%的微生物是可纯培养的,99%以上的微生物是不可纯培养的。长期以来,人们用传统可纯培养方法来研究环境样品微生物,温室土壤样品也不例外,这就阻碍了对微生物多样性的研究和有益微生物资源的挖掘利用。因此,为全面弄清温室土壤中微生物群落结构组成,了解微生物与温室主栽植物、植物病原根结线虫以及微生物内部之间的互作关系；同时,从温室作物病虫害的发生与防控关系最为密切的微生物中筛选出有用的基因资源,本研究采用非培养的手段对微生物的群落结构组成和微生物功能基因的挖掘,尤其是杀线虫蛋白酶基因的挖掘做了初步研究,具体研究结果有以下几点：第一,通过构建古菌16S rRNA和真菌18S rRNA基因克隆文库来分析温室土壤古菌和真菌群落结构组成,为开发利用温室这一特殊的生态环境中丰富的微生物资源以及理解微生物与植物间的互作提供参考依据。采用研磨-冻融-溶菌酶-蛋白酶K-SDS热处理以及CTAB处理等理化方法,提取和纯化微生物总DNA,构建古菌16S rRNA和真菌18S rRNA基因克隆文库。利用DOUTER软件将古菌和真菌序列按照相似性97%的标准分成若干个可操作分类单元（OTUs）。土壤古菌克隆文库主要包括泉古菌门和未分类的古菌两大类,并有少部分广域古菌类群,所有泉古菌均属于热变形菌纲,共45个OTUs；真菌克隆文库包括真菌界的大多数亚门真菌,共24个OTUs,未发现担子菌门真菌。古菌多样性比较丰富,且发现少量的广域古菌（甲烷菌）,出现这一情况的原因可能与温室长期高温高湿,高有机质含量,土壤处于缺氧环境中有关；土壤真菌的优势种群为子囊菌,占到土壤真菌的80%以上,这可能与大多数植物真菌性病害是通过菌丝体、菌核或子囊壳在土壤病残体中越冬有一定的关系。第二,采用16S rRNA基因克隆文库和宏基因组末端测序对温室黄瓜根围土壤细菌的多样性进行了初步分析。根据97%的序列相似性水平划分OUT,共有35个OUT分别属于γ-Proteobacteria、α-Proteobacteria、δ-Proteobacteria和Firmicutes,其中优势菌群是y-Proteobacteria,其次为Firmicutes, Bacillus为优势细菌。在优势种群上,末端测序结果与16S文库分析结果基本一致。但是,宏基因组末端测序包含了大多数的弱势种群,更能反映细菌多样性的真实水平。与露地土壤细菌16S文库相比较,土壤细菌多样性降低,这可能与温室多年连作,种植蔬菜种类单一直接相关。第三,本研究旨在通过非培养手段构建和筛选宏基因组文库,以求找到新型的杀线虫蛋白酶基因。采用密度梯度离心法提取和纯化温室土壤微生物总DNA,经平末端、连接、包装、转染后,构建宏基因组Fosmid文库。该文库库容31,008个克隆,平均插入片段36.5 kb,包含1.13 Gbp的微生物基因组信息,适合大规模的微生物功能基因筛选。同时,以脱脂奶为底物,以根结线虫为靶标,对文库进行功能初筛,共筛选到11个含蛋白酶基因的Fosmid克隆,其中,8个含杀线虫蛋白酶基因。最后,对P11做了进一步研究,构建和筛选出亚克隆（espl14a5）,通过对基因结构进行了初步分析发现：esprol14a5是一种分泌型胞外蛋白酶,与来自于Maricaulis maris MCS10 （accession no. YP756822 at NCBI）的丝氨酸蛋白酶S15仅有45%的同源性,有其保守的催化三元组：Asp469,His541和Ser348。杀线虫室内生物测定和盆栽实验表明：克隆发酵液在无需诱导剂,无需克隆载体上的启动子,就能起到杀线虫的作用。说明该蛋白酶基因有独立的启动子,同时,也说明该蛋白酶是一种分泌型胞外丝氨酸蛋白酶。