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拟南芥中Nuclear Factor Y(NF-Y)转录因子家族成员可以与其他蛋白形成复合物共同转录调控FT参与成花调控,苹果等多年生木本植物的成花特性与拟南芥等模式植物存在显著差异,但相关机制有待解析。本研究以‘长富2号’为试验材料,利用生物信息学分析、酵母双杂交、双分子荧光互补以及双荧光素酶等试验技术,分析苹果Md NF-YB18在协同调控Md FT转录过程中的作用机理。主要研究成果总结如下:1、苹果Md NF-Ys家族成员的鉴定、进化、表达特性以及功能分析。(1)在苹果金冠新基因组中进行蛋白同源性比对,共鉴定出51个Md NF-Ys家族成员,其中Md NF-YAs亚家族成员11个,Md NF-YBs亚家族成员26个,Md NF-YCs亚家族成员14个。(2)对Md NF-Ys家族成员进行的进化与结构分析结果表明,苹果NF-Ys各亚家族成员基因结构与蛋白结构均高度保守,且各亚家族之间差异比较明显。启动子顺式作用元件分析结果表明Md NF-Ys家族成员的启动子上有响应ABA、水杨酸、赤霉素、光信号以及生物钟等调控途径的作用元件,而赤霉素、光信号以及生物钟等调控途径均可以参与成花诱导,表明该家族成员可能通过参与以上调控途径在苹果花芽诱导中发挥功能作用。(3)在对苹果NF-Ys家族成员的表达特性分析中发现,51个家族成员在花、叶以及果实等组织中具有相对高的表达量,且Md NF-YBs家族成员在花组织中表达量较高;在‘长富2号’与‘秦冠’中,Md NF-YB5、Md NF-YB18、Md NF-YC3、Md NF-YC7具有较高的差异表达,结合前期课题组的研究,挑选出Md NF-YB18作为成花关键基因,并通过构建35S:Md NF-YB18过表达载体进行拟南芥转基因,过表达株系表现出较明显的早花性状,表明Md NF-YB18能够促进拟南芥的开花进程。2、Md NF-YB18互作蛋白的筛选、验证与调控机理分析。(1)以Md NF-YB18为诱饵蛋白,在苹果生理分化期花芽文库中,利用酵母双杂交技术进行互作蛋白筛选,共筛选到148个互作蛋白,分别与糖酵解途径、光周期途径、热激蛋白以及抗逆等有关。(2)挑选出与成花相关的蛋白Md NF-YC3、Md NF-YC7、Md NF-YC14、Md14-3-3protein、Md F-box protein、Mdb LHP1-Like、Md MYB62进行互作验证,结果表明Md NF-YB18可以与Md MYB62、Md NF-YC3、Md NF-YC7和Md NF-YC14互作,双分子荧光互补试验结果进一步表明在苹果中可以形成NF-YB/NF-YC二聚体复合物。(3)通过构建Mdp FT-0800LUC载体与Md NF-YB18-62SK载体进行双荧光素酶试验,Md NF-YB18对Md FT启动子有激活作用,表明Md NF-YB18可以直接调控Md FT的转录表达。综上可知,Md NF-YB18可以促进拟南芥成花,在苹果中,Md NF-YB18可以通过激活Md FT来发挥作用。Md NF-YB18可以与Md NF-YC3、Md NF-YC7、Md NF-YC14发生相互作用,形成二聚体复合物。结合前期课题组研究结果,在苹果中可能存在Md COL/Md NF-YB/Md NF-YC--Md FT这样的调控模式参与花芽诱导过程。