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大肠杆菌(Esherichia coli)是应用最广泛的外源基因表达系统之一,然而代谢副产物乙酸的生成和积累,不仅抑制菌体的生长,而且降低外源基因的表达效率,严重地影响了E. coli的生产能力.通过发酵过程控制、选育PTA和ACK突变株、代谢工程等方法,对减少乙酸的生成或避免乙酸的影响、提高外源基因的表达效率都取得了一定的效果.同时,筛选耐乙酸突变株也是改善E. coli细胞性能的有效手段之一.E. coli DH5α由于转化率高是基因工程中最常用的宿主菌之一,但它在基本培养基中生长能力弱,利用碳源速率慢,难于实现高密度培养,限制了在实际生产中的应用.因此,改善它的生长性能及增强它的乙酸耐受力不仅具有重要的实际应用价值,而且具有一定的理论研究意义.该论文主要涉及E. coli DH5α耐乙酸突变株的选育及代谢特性研究.根据DH5α的代谢特性,采用<'60>Co辐射诱变和乙酸选择性压力浓度逐步提高,有机氮源Polypepton浓度逐渐降低的连续培养富集相结合的方法,成功地选育到DH5α的耐乙酸突变株DA系列和DB系列.突变株生长性能改善、遗传性状稳定,表型与DH5α相同.对突变株DA19代谢特性进行了系统的研究.分批培养结果表明,与DH5α相比,在各种复合培养基中,耐乙酸突变株DA19μ<,max>增加,在耐乙酸能力增强的同时产乙酸减少,Q<,A>降低,更快达到稳定期.在以葡萄糖、甘油等为碳源的基本培养基中,DA19生长优势更加明显,利用碳源速率加快,菌体得率大大提高,而Y<,A/X>和Q<,A>降低.在MA培养基中DA19生长优势仍十分明显.DA19在葡萄糖浓度102g/L的基本培养基中能良好地生长并达到较高菌体浓度(26.2g/L).通过变速补料分批培养,DA19不仅可达到较高的菌体浓度,而且可以有效地控制乙酸生成.连续培养结果也显示DA19有较强的生长优势,相近稀释率下菌体浓度大大增加,Y<,X/G>显著提高,Qo<,2>和Q<,G>及Q<,A>降低,产乙酸临界稀释率增加,而DH5α即使在很低稀释率下也有乙酸产生.突变菌外源基因的表达效率提高,在复合培养基中DA19和DB15的hEGF表达水平分别比DH5α提高了89.4％和43.7％.代谢流分析结果显示,DH5α由于Q<,G>太大造成NADPH过渡积累,导致PP途径相对流量很小,代谢之间存在严重不匹配,推断是其在基本培养基中生长差且在很低稀释率下代谢溢流严重易生成乙酸的主要根源.突变的综合结果使出发菌DH5α细胞本身存在的代谢之间严重不匹配状况得到缓解.在相近稀释率下DA19 Q<,G>降低,过量的NADPH大大减少,PP途径相对流量增加,代谢之间的匹配程度提高,结果细胞性能大大改善,产乙酸临界稀释率增加,能量利用效率显著提高.比较Qco<,2>和Qo<,2>实际测量值与代谢流计算值,结果具有一致性.代谢流分布的明显差异表明DA19的代谢调控发生了较大变化.