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背景:2型糖尿病在世界范围内是一种高发疾病,与发病率和死亡率增加密切相关。据估计,2013年有3.82亿成年人患有糖尿病,到2035年这一数字将达到5.92亿。慢性并发症将导致残疾,甚至死亡。发病机制影响因素多,除了传统的机制,近几年还有一些新的思路的提出。其中长链非编码RNAs（lncRNA）被发现在调节癌症,神经退行性疾病,糖尿病和心血管疾病等各种人类疾病中是重要的表观遗传因子。调控ncRNAs的lncRNAs,在基因沉默和基因转录后调控中起重要作用。文献报道长链非编码RNAs在糖尿病中枢神经系统病变中的作用越来越受到重视。了解糖尿病中枢神经系统病变和认知功能障碍的机制对糖尿病的早期预防、评估、干预有帮助。中医药治疗为临床治疗提供新的跟据。目的:研究报道lncRNA和mRNA在健康小鼠组（3只A组）、糖尿病小鼠组（3只B组）、益气补肾中药低剂量药物治疗组糖尿病小鼠（3只C组）、益气补肾中药高剂量药物治疗组糖尿病小鼠（3只D组）海马体组织中的表达差异变化;同时通过体外细胞培养,观察在健康小鼠组（3只A组）、糖尿病小鼠组（3只B组）、益气补肾中药低剂量药物治疗组糖尿病小鼠（3只C组）、益气补肾中药高剂量药物治疗组糖尿病小鼠（3只D组）海马体组织中的蛋白表达变化。以期为寻找2型糖尿病中枢神经系统病变生物过程、病理生理异常基因表达开辟新的思路,进一步揭示疾病通路。方法:1.1取12只小鼠,放置动物房进行饲养,给与自由饮水和饮食。当饲养一周适应环境后,取3只作正常对照组,剩下9只给与禁食,禁食12h后,连续5天以60mg/kg浓度注射1%链脲佐菌素(溶液于腹腔,STZ注射前溶于pH4.5 0.05mol/L柠檬酸钠中,等剂量缓冲液注射于正常对照组小鼠腹腔。10天后检测尾静脉血糖,糖尿病模型小鼠判断标准,血糖≥16.7mmol/L[61]。2组小鼠用生理盐水10ml/kg灌胃,连续灌胃12周。进行体重测量和采尾静脉血测血糖,每周1次。1.2取材末次给予生理盐水结束后0.8%戊巴比妥腹腔注射麻醉小鼠,固定小鼠四肢,暴露腹部,先剪开腹部皮肤及腹膜,然后切开膈肌,最后暴露出心脏,用1ml注射器抽取左心室血液,抽取的血液注入促凝管+分离胶管中,用离心机3000rpm进行离心,时间10分钟,离心后血清置入冻存管,放入-80℃冻存。标本放入离心机后立即进行脑组织的处理,并将海马组织分离,处置好后进行冻存,温度-80℃。1.3晶体芯片实验,样本为小鼠海马体组织提取的RNA,使用晶芯lncRNA+mRNA人V4.0表达谱芯片进行检测,并与Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）数据库进行比对进行基因富集性分析（GO分析）以及信号通路分析,观察其疗效。1.4免疫印迹蛋白质提取从-80 ℃的冰箱里将体外培养的海马组织细胞样本进行裂解、研磨、离心后取上清,进行蛋白质浓度测定,最后经电泳、转膜、孵育、孵抗体、洗膜、曝光等一系列过程观察蛋白表达变化。结果:我们发现36793条不同的lncRNA转录本表达于海马组织。与健康小鼠组相比,糖尿病小鼠组中lncRNAs差异基因130条,其中有126条显著上调、4条显著下调,差异有统计学意义;mRNA中差异基因49条,其中有45条显著上调、4条显著下调,差异有统计学意义。GO分析发现,差异表达的mRNA参与了多种生物学过程,尤其是在炎症反应方面。KEGG分析发现差异表达的mRNA涉及27条通路信号。与糖尿病小鼠组相比,益气补肾中药低剂量药物治疗组中lncRNAs差异基因72条,其中有19条显著上调,53条显著下调,差异有统计学意义;mRNA差异基因97条,其中有0条上调,97条显著下调,差异有统计学意义。GO分析发现,差异表达的mRNA参与了多种生物学过程,尤其是在炎症反应方面。KEGG分析发现差异表达的mRNA涉及57条通路信号。与糖尿病小鼠组相比,益气补肾中药高剂量药物治疗组中lncRNAs差异基因90条,其中有11条显著上调,79条显著下调,差异有统计学意义;mRNA差异基因187条,其中有3条显著上调,184条显著下调,差异有统计学意义。GO分析发现,差异表达的mRNA参与了多种生物学过程,尤其是在炎症反应方面。KEGG分析发现差异表达的mRNA涉及124条通路信号。与益气补肾中药低剂量药物治疗组相比,益气补肾中药高剂量药物治疗组中lncRNAs差异基因56条,其中有20条显著上调,36条显著下调,差异有统计学意义;mRNA差异基因23条,其中有11条显著上调,12条显著下调,差异有统计学意义。GO分析发现,差异表达的mRNA参与了多种生物学过程,尤其是在炎症反应方面。KEGG分析发现差异表达的mRNA涉及64条通路信号。为了进一步验证微阵列数据的可靠性,我们进行了 qRT-PCR。通过使用PubMed数据库检索,选择了在中枢神经系统中具有高表达能力的14种不同mRNA,包括Lmxla、Prr32、Slc5a7、Frem1、Cndp1、Dear1、Otx2、Cpn1、Apls2、Rsrc2、Co19a.3、Kcnt1、Defb11、Dnah7a。进一步通过PCR鉴定,发现其中8个mRNA的差异表达具有统计学意义（P<0.05）,分别是 Lmx1a、Prr32、Cndp1、Otx2、Apls2、Rsrc2、Col9a3、Dnah7a;其中3个mRNA的差异表达具有明显的统计学意义（P<0.01）,分别是Slc5a7、Dear1、Cpn1。RT-PCR显示的表达变化与微阵列数据中观察到的变化有显著差异。T检验表明微阵列数据和qRT-PCR结果之间的一致性,表明我们的微阵列数据是可靠的,可以在后续步骤中用于生物信息学分析。使用健康组小鼠,糖尿病小鼠,中药低剂量组小鼠,中药高剂量组小鼠体外培养的海马组织分别检测Bcl-2、Bax、Capsae-3蛋白的表达水平。结果显示Bax蛋白和Capase-3表达水平变化不大,在糖尿病小鼠中Bcl-2/Bax表达水平降低。结论:GO分析也称基因富集性分析,可用于确认基因和基因生产相关的生物过程、细胞组成和分子功能。GO和KEGG分析可用于进一步评估显著表达趋势基因的功能。在这个实验中,进行浓缩分析包括3个部分:生物过程,细胞成分,分子功能。另外,为验证重要的模块功能我们也进行了 KEGG及Reactome富集分析。在与健康小鼠组的对比中,GO富集分析（能够识别富集的转录物所参与的生物过程）表明,2型糖尿病小鼠海马体病变同运输,细胞粘附,离子转运,代谢过程和其他重要的生物过程有关。另外,为验证重要的模块功能而进行的KEGG及Reactome富集分析表明,胆碱能突触、NF-kB通路、Toll样受体4（TLR4）级联、锌转运蛋白同2型糖尿病小鼠海马体的病理过程相关。实验中我们分析发现2型糖尿病海马组织中 lncRNA 的差异表达谱:lncRNA gi/755552777/ref/XR875577.1/调节SLC5a7,lncRNA gi/755494846/ref/XR387234.2/调节 mLbp。这将有助于 2 型糖尿病中枢神经系统病变病理生理过程的研究。我们将使用PCR和免疫印迹的方法进一步验证具有显著差异表达的基因。在益气补肾中药低剂量药物治疗组与糖尿病小鼠组相比、益气补肾中药高剂量药物治疗组与糖尿病小鼠组相比、益气补肾中药高剂量药物治疗组与益气补肾中药低剂量药物治疗组相比lncRNAs和mRNA的差异表达显著,说明中药益气补肾方作用明显,其作用与运输、细胞粘附、离子转运、代谢过程和其他重要的生物过程有关,同时与调节胆碱能突触、NF-kB通路、Toll样受体信号通路亦有密切关系。在C与B组、D与B组、D与C组实验数据对比中发现了几组显著高表达的基因序列,分别为lncRNA ENSMUST00000188753（在C与B组中下调5.16倍、D与 B 组中下调 7.74 倍）,lncRNA gi/755494846/ref/XR387234.2/（在 C 与 B 组中下调5.93倍、D与B组中下调9.46倍）,及lncRNA gi/755552777/ref/XR875577.1/（在 C 与 B 组中下调 8.06 倍、D 与 B 组中下调12.57倍）;mRNA51P477481（在C与B组中下调6.55倍、D与B组中下调9.05倍）,mRNA A52P308669（在C与B组中下调6.39倍、D与B组中下调5.59倍）,mRNA A55P2062986（在C与B组中下调7.09倍、D与B组中下调14.20倍）,mRNA A55P1983848（在C与B组中下调4.02倍、D与B组中下调6.17倍）。该3组lncRNA与4组mRNA基因序列在药物治疗组中呈现显著低表达的趋势,且表达趋势与药物剂量呈现正相关,中药益气补肾方在治疗效果与药物剂量有密切关系,至于该几组基因在调控NF-κB通路、胆碱能突触中发挥着怎样的调控作用,有待通过实验进一步考证。体外海马细胞培养,蛋白质免疫印迹表明高糖会诱导海马组织中细胞凋亡,而与糖尿病小鼠相比,中药组中,Bcl-2表达水平升高,显示中药处理能够保护海马神经组织。