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目的:宫颈癌是女性最常见的妇科恶性肿瘤,淋巴转移是导致宫颈癌治疗失败和死亡的主要原因。本课题研究早期宫颈癌淋巴管新生与淋巴结转移的相关性,寻找预测宫颈癌淋巴结转移的关键指标,为抑制宫颈癌淋巴结转移、提高宫颈癌疗效提供治疗新靶点。方法:(1)采用透射电镜和光学镜观测宫颈癌内、癌旁、正常区域以及淋巴结周围微小淋巴管的分布和形态特征,分析不同部位淋巴管新生、淋巴管面积、淋巴管侵犯以及淋巴内皮细胞间的开放连接与宫颈癌前哨淋巴结转移的关系。(2)采用免疫组织化学(IHC)和逆转录聚合酶连反应(RT-PCR)技术检测宫颈癌内、癌旁、正常区、前哨淋巴结及非前哨无转移淋巴结组织中VEGF-C/D的表达,分析VEGF-C/D的表达与宫颈癌淋巴管新生、淋巴管侵犯以及与前哨淋巴结转移的关系,探讨癌旁区淋巴管新生、淋巴管侵犯以及前哨淋巴结转移机制。(3)分析癌旁区LVI、SLN检测以及二者联合应用对宫颈癌淋巴结转移的预测价值。结果:(1)宫颈癌组织淋巴管的分布与形态特征:宫颈癌组织内可见极少数塌陷的淋巴管,无法计数;癌旁区淋巴管密度显著高于正常区淋巴管密度(p=0.000);癌旁区淋巴管总面积显著低于正常区淋巴管总面积(p=0.002)。淋巴结转移组癌旁区淋巴管密度和总面积均显著高于无淋巴结转移组(p=0.000,p=0.037)。癌旁区可见肿瘤细胞侵入淋巴管内,正常区无淋巴管侵犯。(2)宫颈癌旁区淋巴管侵犯与前哨淋巴结转移的关系:宫颈癌癌旁区淋巴管侵犯35.29%(18/51),其中前哨淋巴结转移阳性者16例,HE、IHC分别检出前哨淋巴结阳性例数为13例、14例。前哨淋巴结采用HE、IHC检测方法预测宫颈癌前哨淋巴结转移的准确率分别为94%(47/50)、96%(48/50),假阴性率分别为18.75%(3/16)、12.50%(2/16)。宫颈癌癌旁区淋巴管侵犯与宫颈癌淋巴结转移具有一致性(McNemar Test p=0.500)。阳性预测值为83.33%(15/18),阴性预测值为93.93%(31/33),准确率为90.19%(46/51)。(3) VEGF-C蛋白在宫颈癌组织中的表达及临床意义:VEGF-C蛋白在宫颈癌组织中的阳性表达率70.59%(36/51),癌旁区阳性表达率68.63%(35/51);17例转移淋巴结(其中前哨转移淋巴结16例)阳性表达率94.12%(16/17)。宫颈正常组织和非前哨无转移淋巴结均无表达,差异有统计学意义p=0.000)。VEGF-C阳性表达组淋巴结转移率44.44%(16/36)高于VEGF-C阴性表达组6.67%(1/15); VEGF-C阳性表达组宫颈癌浸润深度>1/2者77.78%(28/36),高于VEGF-C阴性表达组13.33%(2/15);VEGF-C阳性表达组宫颈癌淋巴管侵犯44.44%(16/36),高于VEGF-C阴性表达组6.67%(1/15); VEGF-C阳性表达组宫颈癌II期患者47.22%(17/36),高于VEGF-C阴性表达组II期宫颈癌患者13.33%(2/15)(p均<0.05);VEGF-C阳性组宫颈癌癌旁区淋巴管密度和总面积均高于VEGF-C阴性组(p<0.05)。(4) VEGF-D蛋白在宫颈癌组织中的表达及临床意义:宫颈癌组织中VEGF-D蛋白阳性表达率60.78%(31/51),癌旁区阳性表达率56.86%(29/51);17例转移淋巴结(其中前哨转移淋巴结16例)VEGF-D蛋白阳性表达率82.35%(14/17)。宫颈癌正常组织和非前哨无转移淋巴结均无表达,VEGF-D蛋白在宫颈癌组织中、癌旁、前哨转移淋巴结的阳性表达高于宫颈癌正常组织和非前哨无转移淋巴结的表达(p=0.000;p=0.000;p=0.000)。VEGF-D阳性表达组淋巴结转移率51.61%(16/31),高于VEGF-D阴性表达组3.33%(1/30);VEGF-D阳性表达组LVI的发生率48.39%(15/31),高于VEGF-D阴性表达组10%(3/30)(p<0.05)。(5) VEGF-C/DmRNA的表达:荧光定量RT-PCR检测VEGF-C mRNA在宫颈癌内、癌旁、前哨转移淋巴结中的表达显著高于宫颈正常组织和非前哨无转移淋巴结(P<0.01)。VEGF-C mRNA在前哨转移淋巴结中的表达显著高于宫颈癌内和癌旁组织(P<0.05)。VEGF-D mRNA在宫颈癌内、癌旁、前哨转移淋巴结中的表达显著高于宫颈正常组织(P<0.01)和非前哨无转移淋巴结(P<0.05)。VEGF-D mRNA在前哨转移淋巴结中的表达显著高于宫颈癌内(P<0.05),与宫颈癌旁组织比较无显著差异(P>0.05)。VEGF-C/DmRNA在宫颈癌组织中的表达与淋巴结转移、淋巴管侵犯、肿瘤浸润深度方面均有显著性差异(p均<0.05)。(6)核素+染料法检测SLN成功率98.04%(50/51);全部检测SLN141个,均经HE、IHC检测,HE染色检测阳性淋巴结35个(24.82%),IHC检出阳性淋巴结42个(29.79%),HE与IHC之间检出率的差异无统计学意义(p=0.283)。(7)癌旁区淋巴管侵犯阳性18例,其中15例前哨淋巴结转移阳性。淋巴管侵犯-IHC预测宫颈癌前哨淋巴结转移状态的敏感度为93.75%(15/16) ,特异度为90.32%(28/31),准确率为98%(49/50),假阴性率为6.25%(1/16)。联合淋巴管侵犯-IHC和SLN检测预测宫颈癌淋巴结转移敏感度100%(16/16),准确率100%(50/50),假阴性率0%(0/16)。(8)宫颈癌不同临床分期对SLN的影响:全组SLN检测失败1例。Ib1期诊断准确率100%(25/25),Ib2期诊断准确率100%(7/7),IIa期诊断准确率88.89%(16/18),假阴性率16.67%(2/12)。结论(1)宫颈癌淋巴管新生发生于癌旁区,新生淋巴管管腔小,肿瘤细胞通过淋巴管壁的内皮细胞开放连接和破坏癌旁区淋巴管进入淋巴引流,可能是宫颈癌形成淋巴结转移的两种主要方式;癌旁区LVI-IHC有可能成为准确预测淋巴结转移的敏感指标。(2) VEGF-C、D在宫颈癌组织中都表达上调,且有一定的协同性,它们可能参与了宫颈癌发生、发展的过程,在宫颈癌的淋巴结转移中起重要作用;VEGF-C、D既可以诱导宫颈癌癌旁区淋巴管新生又可以促使淋巴管侵犯、淋巴结转移增加。VEGF-C、D有可能成为预测宫颈癌淋巴结转移的关键指标,并可能成为抑制宫颈癌淋巴结转移、提高宫颈癌疗效的治疗靶点。(3)对Ib期宫颈癌联合应用LVI-IHC和前哨淋巴结检测,可以提高诊断的敏感度,降低假阴性率。