卵巢上皮性癌（epithelial ovarian cancer，EOC）（以下简称为卵巢癌）是恶性肿瘤的第五大杀手，在妇科恶性肿瘤中死亡率居于首位[1]。标准的治疗模式是彻底的肿瘤细胞减灭术合并铂类为基础的化疗方案，但较高的耐药性和不可避免的复发对传统的最大耐受剂量间断化疗的模式，即MTD（maximum tolerated dose）模式发出挑战[2]。而我们首先要做的是寻找肿瘤耐药、复发的根源。近年来，研究发现恶性肿瘤的生长、转移、化疗耐药和复发与肿瘤干细胞（cancer stem cell,CSC）密切相关。在实验肿瘤学方面，目前CSC的定义：可自我更新或再生的部分恶性细胞，可成功地异种移植并呈现与原肿瘤相同的具有异质性的细胞表面标志物或表型[3]。通常情况下化疗能够杀灭大多数增殖状态的肿瘤细胞，残存CSCs能够充填原来的空缺，形成新的瘤灶[4]。然而CSCs的子细胞也可遗传CSCs的耐药性特征，导致复发癌的化疗低反应。研究证实CSCs的数目与肿瘤难治性成正比[5]。一系列动物实验已证明MTD化疗模式能富集CSCs[6]，为复发埋下隐患。因此，我们推测，减少残存肿瘤中的CSCs，使原有的无分化潜能的肿瘤细胞处于主要地位，能够有效地保持化疗的敏感性，可能成为抵抗耐药、降低复发率、改善预后的突破口。低剂量持续化疗（low-dose metronomic chemotherapy，LDM）作为一种新的化疗模式于2000年由Browder等[7]首次提出并得到关注。胰腺癌、脑胶质瘤等异体移植瘤实验中发现LDM化疗后肿瘤中CSCs比率减少[8]。因此，LDM为基础的化疗模式可能对CSCs针对性治疗更有效，有望为临床卵巢癌治疗提供新思路。目的:1CSCs是导致化疗后肿瘤耐药、复发的根源。本研究通过对裸鼠荷人卵巢癌SKOV3模型模拟进行顺铂MTD及LDM模式化疗，检测不同化疗模式对卵巢上皮性癌CSCs样细胞的影响,以期为临床治疗提供新思路。2本研究应用CD133单克隆抗体进行细胞分选，并测定CD133阳性细胞的干细胞特性，进而探讨CD133作为卵巢癌CSCs标记物的可行性。方法:1建立裸鼠异种移植瘤模型并进行不同模式化疗，定时监测肿瘤生长情况及化疗副反应。将卵巢上皮性癌SKOV3细胞1×107个，0.2ml无血清培养基重悬，接种于16-18g雌性裸鼠右侧的大腿皮下，建立皮下异种移植瘤模型。2-3周后，当移植瘤体积达150-200mm3时，将裸鼠随机分为三组即MTD组、LDM组、对照组。MTD组给予顺铂3mg/kg腹腔注射，3天为1周期，共6个周期；LDM组1mg/kg连续化疗18天；对照组给予等量生理盐水。每天腹腔注射前称重裸鼠，每3天测量并记录移植瘤的体积、食量,每6天抽取尾静脉血检测白细胞。同时在实验过程中，密切观察化疗对裸鼠的副反应，包括体重的下降、食量减少、白细胞减少情况、行为和饮食的变化以及皮肤颜色的改变。2流式细胞分选术分离并获得CD133阳性细胞和阴性细胞。化疗结束后3-7天，获得三组肿瘤原代细胞。采用CD133荧光抗体标记后细胞表现出不同的荧光强度，经过流式细胞分选术分离获得两群细胞，即：荧光较强的细胞群（定义为CD133阳性细胞）和荧光相对较弱的细胞群（CD133阴性细胞）。3测定CD133阳性细胞的部分CSCs样特性。3.1体外克隆形成实验观察分选所得CD133阳性及CD133阴性细胞克隆形成率。由于流式细胞分选后所得CD133阳性细胞数目较少，且一部分在实验中受损失去活性，本实验将三组细胞所得CD133阳性细胞混合培养，3天后细胞换液并选取活性好的贴壁细胞进行体外克隆形成实验，CD133阴性细胞给予相同处理。两种细胞同时接种于6孔板，每种细胞3个孔，待出现肉眼可见克隆时终止实验，重复试验3次，比较两种细胞克隆形成情况，并计算各自的克隆形成率。3.2Western blot方法检测CD133阳性细胞与CD133阴性细胞中乳腺癌耐药相关蛋白（BCRP）的表达。应用Western blot方法检测蛋白，细胞数目至少达105，而流式细胞分选所得CD133阳性细胞较少，不足以分组进行蛋白测定，因此将3组肿瘤细胞分选后所得CD133阳性细胞直接混合后提取蛋白进行BCRP和下面所述的Ki-67蛋白的测定。CD133阴性细胞同样混合后实验。每组实验重复3次。3.3Western blot方法检测CD133阳性细胞与CD133阴性细胞中的Ki-67蛋白的表达。4统计学方法：采用SPSS13.0统计软件进行数据统计，计量资料以均数±标准差表示，方差齐性检验，三组以上采用方差分析，组间差异采用LSD法，两组数据比较采用t检验，以α﹦0.05为检验水准，当P＜0.05时，差异有统计学意义；当P＞0.05时，差异无统计学意义。结果:1LDM较MTD模式化疗更明显地抑制肿瘤生长,且副反应可耐受。将SKOV3细胞1×107个接种于30只雌性裸鼠右侧大腿皮下，成瘤率为100%，2-3周后当移植瘤体积150-200mm3时，将裸鼠随机分为三组：MTD组、LDM组、对照组，移植瘤平均体积差异无统计学意义（P>0.05）。化疗结束时，统计三组移植瘤平均体积分别为564.72±43.89mm3、382.25±28.09mm3、782.01±34.24mm3，两两之间差异均有统计学意义。根据公式，抑瘤率=（对照组移植瘤平均体积-实验组移植瘤平均体积）/对照组移植瘤平均体积×100%，计算抑瘤率：MTD组抑瘤率为27.78%，LDM组抑瘤率为51.12%。表明LDM化疗较MTD模式对于肿瘤生长的抑制更有效。化疗过程中，MTD组和LDM组与对照组比较，裸鼠均出现体重减轻（P<0.05）、食量减少（P<0.05）、白细胞减少（P<0.05）、精神萎靡等副反应，但根据化疗副反应的分级，化疗副反应属于Ⅰ级，表明裸鼠能够一定程度的耐受化疗。LDM组较MTD组化疗副反应未发现明显差异，上述指标在两组数据统计中均无统计学意义（P>0.05）。2MTD化疗能富集肿瘤中的CD133阳性细胞，而LDM化疗则降低其在肿瘤中的表达。流式细胞分选术检测CD133阳性细胞在LDM组肿瘤中所占比率（0.247%±0.021%），明显低于对照组（0.413%±0.021%，P=0.001）。而MTD组CD133阳性细胞比率为（1.463%±0.208%）较对照组显著升高（P=0.000）。结果表明，传统的MTD化疗能富集CD133阳性细胞，而LDM模式则显著降低其表达。3CD133阳性细胞表现出部分CSCs样特性。3.1CD133阳性细胞较CD133阴性细胞显示较强的克隆形成能力。应用体外平板克隆实验比较CD133阳性细胞和CD133阴性细胞的克隆形成能力：将两种细胞制备单细胞悬液，接种至6孔板中，每种细胞3孔，每孔接种500个细胞，2-3周后出现肉眼可见的细胞克隆时终止培养，镜下计数细胞数>30个的克隆球。重复实验3次。克隆形成率(%)=克隆数/接种细胞数×100%，统计CD133阳性细胞的克隆形成率(49.8%±2.03%)显著高于CD133阴性细胞（3.31%±0.61%，P=0.00）。结果表明，CD133阳性细胞具有更强的克隆形成能力，这也是CSC鉴定的一个重要条件。3.2CD133阳性细胞较CD133阴性细胞耐药性强。耐药蛋白BCRP能独立或联合经典耐药蛋白P-糖蛋白（P-gp）、多重耐药蛋白（MRP）介导多药耐受。Western blot结果显示，耐药蛋白BCRP在CD133阳性细胞中表达（0.677±0.032）显著高于CD133阴性细胞(0.228±0.018，P<0.05)。3.3CD133阳性细胞增殖活性较CD133阴性细胞差。Ki-67是一种增殖细胞相关的核抗原，在细胞增殖中不可或缺，只表达于增生的细胞，静止的细胞中不表达，通过检测Ki-67蛋白了解恶性肿瘤的细胞增殖活性。Western blot检测Ki-67蛋白在两种细胞中的表达结果：CD133阳性细胞（0.215±0.001）vs阴性细胞（0.739±0.009），P<0.05。提示CD133阳性细胞较阴性细胞增殖活性差，符合CSCs的休眠的存在状态的特性。结论：1顺铂LDM模式化疗较传统MTD化疗能显著减缓裸鼠移植瘤的生长，并能耐受化疗副反应。2CD133阳性细胞表现出部分的CSC样特性。3顺铂LDM模式化疗可降低卵巢癌移植瘤中CSC样细胞的比率，与MTD化疗能富集干细胞相比较，可能更有助于减少耐药性、降低复发率，改善患者预后。