内生菌是其生活史中的某一段时期或全部时期无症状地生活在植物组织内的真菌或细菌。近二十年来，人们开始关注并进行内生真菌的研究。从目前已经研究过的植物来看，内生真菌在植物中普遍存在，二者在协调进化过程中形成了互惠共生关系。内生真菌一方面可以从宿主中吸收营养供自己生长需要，一方面在宿主的生长发育和系统演化过程中起重要作用如：增强宿主的生长、抗干旱能力、抗病虫害能力、产生有生理活性的代谢物质等。内生真菌在生态环境中扮演的众多角色，尚待发掘的丰富资源和具有药用价值生理活性代谢物，构成内生真菌研究的巨大动力。但相对于其他真菌类群的研究来说，我们对内生真菌的认识还很肤浅，绝大部分植物内生真菌群落仍然是未知的。 内生真菌能产生与宿主相同或相似的具有生理活性的代谢产物，利用能产生生理活性物质的内生真菌发酵生产治疗疾病的药物，可以节约天然植物资源和保护生态环境。药用植物肖菝葜，为菝葜科肖菝葜属常用中草药，其干燥根茎或者整个植株被称为“白土茯苓”入药，具有利尿，除湿，解毒，通利关节等功能。肖菝葜内生真菌是否可以产生有生理活性的次生代谢产物呢?关于肖菝葜内生真菌的研究尚未见报道。本文利用分子生物学技术研究药用植物肖菝葜内生真菌生物多样性，旨在为探索肖菝葜内生真菌的巨大潜在应用价值提供基础研究。 本论文采用光镜观察和分子生物学技术，对肖菝葜春季和夏季茎组织内生真菌多样性进行研究。作者用苯胺蓝染色光镜观察法直接观察在肖菝葜茎组织内部内生真菌的分布情况。肖菝葜茎组织是柱状体，横切面近似圆形，皮层细胞内散布着被苯胺蓝染色的真菌菌丝。夏季采集的样品在皮层细胞的第2-3层散布，而春季采集的样品在皮层细胞的第5-6层致密分布。通过直接观察分析，春季肖菝葜茎组织内生真菌较夏季丰富。 为了考察内生真菌群落构成，分别提取春、夏两季茎组织的总DNA，利用真核生物通用引物LH2/Sm73选择性扩增核糖体转录间隔区(rDNAITS区)片段，结果表明，LH2/Sm73成功地同时扩增出植物和真菌rDNAITS目的片断。PCR产物经割胶纯化，分别构建春、夏两季茎组织内生真菌以及植物ITS区序列的克隆文库。真菌文库分别随机筛选150个克隆子，植物文库筛选19个阳性克隆子。对阳性克隆子的插入片段进行限制性内切酶酶切片段长度多态性(RFLP)分析，对每一种RFLP型的克隆子进行序列测定和生物多样性分析。结果表明：植物rDNAITS文库的阳性克隆子RFLP型具有同质性，经测序分析为植物rDNAITS区序列。夏季肖菝葜文库(XJB)筛选的14个RFLP型全部被春季肖菝葜文库(YJ4)筛选出的44个RFLP型覆盖，表明春季肖菝葜茎组织内生真菌群落较夏季更为丰富。 从YJ4文库的每种RFLP型中随机挑选不少于两个克隆子，其质粒DNA用载体通用引物P47或P48进行序列测定。使用Blastn程序，对测定的序列与国际基因数据库GenBank和EMBL中的相关序列进行同源性分析，这49条序列可以归入真菌域。在49个真菌rDNAITS区序列中只有YJ4-Ⅲ4，与担子菌同源性较高，其余48条rDNAITS区序列，与子囊菌同源性高。49个真菌序列中，有12个序列与GenBank数据库中最近源序列相似率在99％以上，其中YJ4-1，YJ4-26和YJ4-46与其最近源序列相似率为100％；有9个序列与近源序列相似率在90％到98％之间；有13个序列与近源序列相似率在75％到90％之间；有15个序列与已知的ITSrDNA序列相似率在75％以下，其中YJ4-93与近源序列相似率为47.0％。 生物多样性分析表明内生真菌主要的群落构成为：球腔菌属(Mycosphaerella)，拟茎点霉属(Phomopsis)，小丛壳属(Glomerella)，短梗霉属(Aureobasidium)，枝孢属(Cladosporium)，壳梭孢属(Fusicoccum)，球座菌属(Guignardia)，葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)和锈菌纲(Urediniomycetes)。其中球腔菌属(Mycosphaerella)，拟茎点霉属(Phomopsis)，小丛壳属(Glomerella)和短梗霉属(Aureobasidium)为主要优势类群。还有几个序列，如YJ4-61，与基因数据库内的序列同源性非常低；有些序列，如YJ4-9和YJ4-70与环境样本的序列相似率很高。 本研究首次通过肖菝葜茎组织rDNAITS文库的构建和分析，综合运用分子生物学、生物信息学和分子系统学的方法，探讨肖菝葜茎组织内生真菌生物多样性，并深入比较分析春、夏两季肖菝葜内生真菌群落结构差异。揭示了肖菝葜内生真菌群落构成具有十分丰富的多样性，且其构成与丰度受组织类型和气候类型等因素影响而发生变化。同时也为开发和利用肖菝葜内生真菌这一特殊的生态资源奠定基础。