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目的：1.建立Arresten蛋白的JM109/pBV221/Arresten原核表达体系；2.研究Arresten蛋白的纯化方法,建立Arresten蛋白的制备工艺；3. Arresten蛋白纯品的药效学研究。方法：1.内源性血管生成抑制因子Arresten原核表达体系的建立从GenBank中获取Arresten基因序列,设计引物,在其羧基端加入六联组氨酸标签。从健康产妇胎盘组织中提取总RNA,经逆转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出Arresten基因,将基因克隆入pMD19-T载体中,测序确认。经限制性内切酶EcoR I、Sal I双酶切,将Arresten基因定向插入表达载体pBV221,转入大肠杆菌JMl09进行温控诱导表达。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫蛋白印迹技术I(Western blotting)对表达产物进行分析鉴定。2. Arresten蛋白的纯化超声破菌,分离得到包涵体,在变性条件下采用金属螯合亲和层析(MAC)方法纯化Arresten蛋白。使用Ni2+-NTA亲和柱,通过pH洗脱和咪唑洗杂结合的方法,对洗脱缓冲液和洗杂缓冲液进行优选,探寻Arresten蛋白的最优纯化条件,用BCA法测定纯化产物的蛋白含量,SDS-PAGE电泳检测纯化产物的纯度,并进一步对纯化产物复性。3. Arresten蛋白的药效学研究(1) Arresten蛋白作用于体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人宫颈癌细胞(HeLa):MTT法检测Arresten蛋白对HUVEC和HeLa细胞增殖能力和黏附能力的影响；流式细胞仪分析Arresten蛋白作用下两种细胞凋亡的情况；细胞侵袭试验观察Arresten蛋白对两种细胞侵袭能力的影响。(2)鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验观察Arresten蛋白对新生血管的抑制情况。(3)建立小鼠移植瘤模型,随机分组,治疗组瘤体内以3.2mg/kg剂量直接注射Arresten蛋白,对照组注射0.1ml生理盐水,每2天一次,共10天。观察瘤体大小变化、小鼠活动能力、饮食等状况。10天治疗后处死小鼠,摘取肿瘤,称量瘤重,计算肿瘤体积(tumor volume,TV)、相对肿瘤体积(relative tumor volume,RTV)及相对肿瘤抑制率。利用CD31抗体染色免疫组化方法检测肿瘤组织血管生成情况。结果：1.测序结果和酶切鉴定证实Arresten基因正确地插入表达载体中。经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,重组体Arresten在大肠杆菌JM109中获得表达,分子量约为26000,表达量约占菌体总蛋白的30%。经Western blotting检测表明该异源重组蛋白具有添加的亲和纯化标签His-tag的抗原活性。成功构建了有效的原核表达体系JM 109/pBV221/Arresten。2.通过对洗脱缓冲液和洗杂缓冲液的优化研究,发现采用含有15mM咪唑的洗杂缓冲液洗涤杂蛋白,能有效减少杂质蛋白的非特异性结合；调整洗脱缓冲液pH值为5.1,可使目的蛋白更好的洗脱下来。建立了最适宜于Arresten蛋白的纯化方法,可以一步得到纯度在97%以上的Arresten蛋白。3.浓度0.8μg/ml的Arresten蛋白能有效抑制HUVEC的增殖、侵袭(P<0.01),引起HUVEC的凋亡(P<0.01),并且在一定范围内随着Arresten蛋白浓度的增加,抑制作用与致凋亡作用明显加强。Arresten蛋白对HeLa细胞基本没有抑制增殖和致凋亡作用,有一定抑制HeLa细胞侵袭的效果(P<0.05),但没有明显的浓度依赖性。Arresten蛋白能明显减少HUVEC与HeLa细胞之间的黏附(P<0.01),0.8μg/ml的Arresten蛋白对其黏附抑制率为42.7%,再增加Arresten蛋白浓度,抑制率基本不变。4. Arresten蛋白能有效抑制鸡胚尿囊膜血管的生长(P<0.01),特别对中小血管的抑制作用较为明显。经Arresten蛋白作用,血管数目明显减少,血管辐辏低,以非特异性的杂乱、平行、贯穿等表现形式为主,出现血管细小稀疏、分支少、甚至血管断裂、毛细血管消失等现象。5. Arresten蛋白注射治疗组小鼠治疗前后饮食、行为无明显异常,反应能力、营养状况良好,Arresten蛋白在小鼠体内未引起明显免疫反应。在治疗第5天瘤体增长速度开始减慢,7天后肿瘤体积开始缩小。而阴性对照组小鼠随着时间延长,肿瘤呈进行性生长,饮食、活动和反应能力逐渐变差,后期呈恶病质态。治疗第10天Arresten蛋白组小鼠瘤重0.88±0.25g,瘤体积为765.19±249.41mm3,相对肿瘤体积为1.83±0.99,显著低于阴性对照组(P<0.01)。相对肿瘤抑制率为80.81%。经CD31多克隆抗体检测发现,治疗组瘤组织内血管形成明显减少。结论：本研究应用基因工程技术,在Arresten基因序列羧基端引入特异性纯化标签六联组氨酸标签,成功构建了原核表达体系JM109/pBV221/Arresten.通过对其纯化条件的研究,建立了纯度97%的Arresten蛋白的制备方法。生物学活性研究证明,纯品Arresten蛋白具有良好的抑制血管生成及抑制肿瘤浸润转移作用,对小鼠移植瘤有治疗效果。本研究是新型抗肿瘤制剂Arresten蛋白新药申报材料的核心组成部分,为Arresten蛋白的开发奠定了基础。