玉米是世界上生产和消费最广泛的谷物之一,除了用作人类食物和动物饲料外,还广泛用作淀粉、油、食品添加剂和燃料乙醇及其他产品的工业原料。随着人口的不断增长和气候变化的威胁,确保玉米产量持续增长的能力变得越来越重要。提高玉米产量和改良品质（即氨基酸含量、赖氨酸和色氨酸含量、淀粉/直链淀粉/支链淀粉含量）一直是作物科学研究的重点。在过去几十年中,已经发现了多个转录因子、植物激素、酶等因子参与调控玉米籽粒发育和合成代谢。由于玉米种子发育是多个基因协同调控的复杂过程且对环境条件变化十分敏感,因此深入了解胚乳发育和分子调控网络对植物科学家和育种家具有重要意义。本实验室在田间发现一个自然变异的玉米籽粒突变体,由于该突变体籽粒胚和胚乳发育异常,具有皱缩、不透明的表型,命名为“Shrinken 2008（sh2008）”。利用图位克隆技术分离出决定该表型的目的基因Zm Thx20,并对其功能进行分析。这项研究对于了解玉米胚乳发育的调控和分子网络具有重要的作用。具体结果如下:1、突变体sh2008的表型鉴定突变体sh2008的种子在授粉后12天的果穗上能明显区分出来,并一直表现为乳白色。随着授粉天数的增加,籽粒顶部出现塌陷,待完全成熟后逐步变干瘪、皱缩。sh2008百粒重仅为野生型的30%,种子萌发试验表明大部分突变型种子不能萌发。单独剥取授粉后20天的种子胚放置于1/2MS培养基上培养,发现突变型胚和野生型胚在萌发率方面没有差异,但突变型胚发育延迟,小苗移栽后长势较弱。在正常管理条件下突变体胚长成的植株能够正常开花和授粉结实。突变型籽粒的总淀粉含量仅为野生型的26%,总贮藏蛋白约为野生型的70%。SDS-PAGE表明突变体籽粒玉米醇溶蛋白含量减少,尤其是19 kDa α-和22 kDa α-玉米醇溶蛋白。在籽粒灌浆期突变型籽粒的可溶性糖含量一直维持在一个较高水平,游离氨基酸中天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸和γ-氨基丁酸的含量也与对照有明显差异。石蜡切片观察发现突变型籽粒中胚乳传递细胞层面积较小,胚乳淀粉颗粒的积累少。使用扫描电镜进一步观察成熟种子自然断面,发现突变型籽粒中的淀粉颗粒较为松散,周围的蛋白质基质较少,并且在淀粉颗粒表面出现很多不规则的孔洞。综上所述,基因突变严重影响了玉米籽粒中胚乳的发育。2、突变体的遗传学分析将杂合型突变体与不同遗传背景的玉米自交系杂交,突变表型能稳定遗传。统计F2代分离型果穗上野生型与突变型籽粒数目比例为3:1,符合孟德尔遗传分离定律。因此该隐性性状受一个核基因调控。3、突变体基因的图位克隆与遗传互补验证以sh2008/B73 F2群体为研究对象,采用BSA混池原理,将目标基因定位于玉米5号染色体长臂上178-208M范围内。进一步开发分子标记,最终将基因锁定在标记M190-2和M190-6之间。分析该区间内的候选基因,对其表达量进行半定量分析,并将不同基因型的表达量进行比较,进一步筛选候选基因。采用PCR扩增野生型和sh2008的候选基因片段并测序分析,发现ZmThx20（Zm00001d017420）基因第二外显子中存在多个插入缺失片段,其中T碱基（+2246bp）缺失导致终止密码子提前出现,而区域内其他候选基因的序列没有变化。推测ZmThx20突变导致sh2008表型发生。转基因互补试验表明,过表达基因Zm Thx20可以恢复sh2008表型。使用CRISPR/Cas9系统编辑玉米野生型愈伤组织细胞中的Zm Thx20基因,再生的编辑植株套袋自交结籽,部分籽粒出现皱缩、发白的表型。4、基因的功能分析Zm Thx20属于植物特有转录因子Trihelix家族成员,进化树分析表明其属于三螺旋转录因子家族中GT-2亚家族。RT-qPCR表达分析表明ZmThx20在不同的组织部位中均有表达,其在叶片和根中表达量较高。Zm Thx20在授粉后8天的籽粒中即可检测到表达,在灌浆期维持高位水平,此后表达量下降,一直持续到籽粒成熟。亚细胞定位显示Zm Thx20只定位于细胞核。酵母自激活试验证明转录因子Zm Thx20全长没有自激活活性,但是其N端具有自激活活性。酵母双杂交筛选到多个结合蛋白的基因,但这些基因编码的蛋白大都定位于细胞质中,只有少量定位于细胞核。荧光素酶互补试验证明另一个三螺旋转录因子Zm Thx39可以与Zm Thx20互作,推测ZmThx20以多聚复合体的形式行使调控作用。酵母单杂交和双分子荧光互补试验表明,转录因子Zm Thx20可以结合到19kDaα-zein基因的启动子区域,并显著提高靶基因的转录活性。转录因子Zm Thx20直接或间接影响17个编码19kDa玉米醇溶蛋白的基因和11个编码22 kDa玉米醇溶蛋白的基因的表达,导致sh2008突变体中醇溶蛋白含量减少。5、Zm Thx20基因突变导致淀粉合成代谢紊乱对授粉后15天的sh2008突变型籽粒进行转录组测序分析,发现基因突变导致4394个基因表达上调和2290个基因表达下调。对差异基因进行GO富集分析,发现差异基因大部分富集在蛋白质翻译、核糖体和营养库活性等条目中。检测调控淀粉合成和存储蛋白质编码基因的表达水平,发现突变型籽粒都出现与野生型不同的变化,这些变化导致胚乳发育和种子贮藏物储备的缺陷。