论文部分内容阅读
COPD是一种具有气流受限特征的疾病，这种气流受限不完全可逆，常呈进行性发展，与肺部对有害气体或有毒颗粒的异常炎症反应有关。迄今为止，尚缺乏有效遏制COPD进展的治疗药物。吸入糖皮质激素虽然在哮喘的治疗中具有显著疗效，但现有研究结果表明，它不能有效遏制COPD的气道炎症，减缓COPD的疾病进展以及降低死亡率。故在COPD中可能存在糖皮质激素反应的降低。真核生物中，构成核小体的核心组蛋白氨基末端的乙酰化修饰对基因的转录具有重要的调控作用。糖皮质激素抗炎作用的发挥有赖于它对促炎症基因转录的抑制。这一过程是通过其与转录因子NF-κB、AP1等结合的具有潜在HAT活性的共活化分子（CBP/p300、PCAF等）的相互作用，并有效募集HDAC2到激活的共活化分子复合物部位使已乙酰化的核心组蛋白去乙酰化来实现的。研究显示，吸烟和氧化应激均能增加肺泡巨噬细胞的核心组蛋白乙酰化并激活促炎症基因的转录，该作用与细胞内HDAC2的表达下调有关。同时，糖皮质激素对IL-1β介导的TNF-α和IL-8表达的抑制作用在吸烟者的肺泡巨噬细胞中明显减弱，因此HDAC分子的表达及其功能可能与糖皮质激素反应间存在十分密切的关系。然而这种关系在肺结构细胞中的情况及其分子机制仍不明确，有待深入研究。第一部分香烟烟雾提取物的制备与检测及其对人肺泡上皮样细胞A549的增殖抑制作用目的：建立CSE制备和检测定标的方法，观察其对人肺泡上皮样细胞A549细胞增殖的影响，探讨其中可能的分子机制。方法：制作基于恒流蠕动泵的CSE制备装置，应用反相高效液相色谱检测CSE中稳定成分尼古丁的含量。利用MTT法和LDH法观察CSE对A549细胞增殖的影响。通过荧光显微镜观察CSE对A549细胞的细胞形态学变化，经Western blot检测相关蛋白的表达水平，揭示CSE对A549细胞增殖影响的可能机制。结果：经反相高效液相色谱检测制备的CSE中尼古丁的含量为369.2±21.6μg/ml（CV 5.9％，n=6）。CSE对A549细胞具有明显细胞增殖抑制作用，这种作用呈时间依赖和浓度依赖性，其作用24hr的IC50值为37.7％，95％可信区间为29.1％～34.6％；IC5值为5.1％，95％可信区间为1.6％～8.1％。经吖啶橙和碘化丙啶双染荧光显微镜观察发现，CSE呈浓度依赖的增加A549细胞的坏死率，而对细胞的凋亡影响不大，其中10％CSE刺激组细胞坏死率为7.3％±3.3％，细胞凋亡率为3.8％±1.1％；25％CSE刺激组细胞坏死率为34.4％±6.7％，细胞凋亡率为3.8％±1.1％。进一步对凋亡相关蛋白caspase3和caspase9的蛋白表达水平检测发现，两者均未出现较对照组表达水平明显的变化。而对凋亡抑制蛋白survivin和XIAP的蛋白表达水平检测表明，CSE可以呈浓度依赖的增加survivin和XIAP的表达，但两者的趋势并不完全一致，在25％CSE刺激时survivin的表达水平出现明显下调，而XIAP则无。同时对IκB及其磷酸化水平的检测发现，两者在CSE刺激后与对照组比较无表达水平的改变，而且胞浆与胞核的Re1A/p65表达水平亦基本一致，不受CSE刺激的影响。第二部分香烟通过酪氨酸硝基化和SUMO化降低A549细胞HDAC 2的活性和糖皮质激素反应目的：观察CSE对A549细胞促炎症细胞因子和趋化因子表达、组蛋白H4乙酰化状态与HDAC2蛋白表达和功能之间的关系，并用地塞米松干预了解CSE对糖皮质激素反应的可能作用，明确其与HDAC2蛋白表达和功能的关系及可能的调控机制。方法：用半定量RT-PCR检测CSE刺激及10-6～-10M地塞米松干预对A549细胞IL-1β、IL-8、GM-CSF、MCP-1、MIP-1α、RANTES mRNA表达水平的影响，用间接免疫荧光法检测不同干预刺激后A549细胞核内组蛋白H4的乙酰化水平。Western blot与化学比色法分别检测HDAC2蛋白表达及其功能与CSE刺激、地塞米松干预之间的关系。然后用实时定量荧光RT-PCR检测明确相应干预刺激对HDACs和HATs分子mRNA水平的影响，再用免疫共沉淀和Western blot检测HDAC2蛋白的酪氨酸硝基化、泛素化、SUMO化水平。结果：CSE刺激可以显著上调IL-1βmRNA的表达（P＜0.01）而对GM-CSF、IL-8、MCP-1、MIP-1α和RANTES mRNA表达的影响无统计学意义（均P＞0.05）。同时，经10-10和10-8M地塞米松干预，对CSE诱导的IL-1βmRNA表达变化无统计学显著意义（均P＞0.05），10-6M地塞米松虽可显著抑制CSE诱导的IL-1βmRNA的表达（P＜0.05），但仍较对照组显著增高（P＞0.05）。而CSE可以显著抑制HDAC2蛋白的表达和活性（P＜0.01），促进组蛋白H4的乙酰化（P＜0.01）；但地塞米松对这种作用无显著影响。进一步检测发现，无论单独CSE刺激还是与地塞米松共干预对HDACs的mRNA水平无显著影响（P＞0.05）。但HDAC2蛋白的酪氨酸硝基化修饰和SUMO化修饰在CSE刺激后均发生显著改变，前者升高，后者降低；而地塞米松对上述变化无明显影响。第三部分SUMO-1修饰对HDAC 2功能的调控目的：通过分子克隆和定点突变技术分析HDAC2蛋白SUMO化修饰的靶位，明确SUMO化对HDAC2功能的影响，初步揭示其中的潜在机制。方法：用分子克隆技术构建HDAC2-HA、SUMO-1-FLAG、Ub-FLAG真核表达载体，用PCR定点突变技术构建HDAC2-K462R真核表达载体。通过脂质体介导质粒转染、免疫共沉淀、Western blot确定HDAC2的SUMO化修饰位点，并检测其活性变化。然后观察HDAC2分子的SUMO化修饰对其与转录抑制辅助分子间相互作用的影响。结果：成功构建HDAC2-HA、SUMO-1-FLAG、Ub-FLAG和HDAC2-K462R真核表达载体。用HDAC2-HA、HDAC2-K462R分别与SUMO-1-FLAG和Ub-FLAG共转染，经免疫共沉淀和Western blot检测发现，K462是HDAC2分子的SUMO化靶位，SUMO化修饰对HDAC2蛋白的泛素化水平无显著影响。在Hela细胞内，野生型HDAC2分子较SUMO化位点突变的HDAC2分子的活性显著为高（P＜0.01）。进一步检测发现，HDAC2蛋白的SUMO化修饰对它与mSin3A、Mi2、RbAp46/48、YY1分子的相互作用无影响，但可以显著降低与CoREST分子和HDAC1分子的相互作用。结论（1）应用恒流蠕动装置和高效液相色谱技术建立了一整套用于CSE制备、检测定标的方法。该方法具有较好的可重复性，为后续实验奠定了基础。（2） CSE对人肺泡样上皮细胞A549具有明显的细胞毒作用，这种细胞毒作用几乎不通过细胞凋亡途径而由细胞坏死途径介导。其发生凋亡抑制的机制与上调凋亡抑制蛋白survivin和XIAP的表达，抑制caspase9和caspase3的活化有关。而前者的变化不受NFκB信号转导通路的调控。（3） CSE可通过抑制A549细胞HDAC2分子的功能促进组蛋白H4的乙酰化导致染色体重构，从而上调促炎因子IL-1βmRNA的表达。糖皮质激素不能显著下调A549细胞促炎因子IL-1βmRNA的水平，表现为糖皮质激素反应的耐受。CSE介导的HDAC2功能下调和糖皮质激素反应减弱与CSE所致的HDAC2分子的两种翻译后修饰酪氨酸硝基化的上调和SUMO化的抑制有关。（4） HDAC2分子的462位赖氨酸残基是HDAC2分子发生SUMO化修饰的靶位。HDAC2分子的SUMO化修饰可以显著影响其HDAC功能。其机制与其泛素化水平无关，可能与影响CoREST复合体的完整性有关。