碳酸钙微球具有pH敏感特性而易于实现溶酶体逃逸来增强细胞免疫,并且钙离子能够促进免疫细胞活化,因此具备开发为疫苗佐剂的潜力。碳酸钙微球众多制备方法中最简单的是钙盐和碳酸盐参与的复分解法,但存在粒径不均一、重现性差,在无添加物的水溶液中难以得到小粒径微球等问题。针对此现状,本论文优化了复分解法制备碳酸钙微球的反应参数,进一步制备小粒径的碳酸钙微球,并考察其理化性质(表面电荷、粒径、剂型等)对佐剂活性的影响,分析作用机制,为无机纳微颗粒佐剂的合理设计提供新思路和理论依据。具体研究内容包括以下五个方面:1)采用氯化钙和碳酸钠反应生成碳酸钙沉淀,系统优化反应参数,调控碳酸钙颗粒形态结构,在最优条件下制得了粒径均一、约4 μm的载抗原碳酸钙微球,再利用静电相互作用在微球表面镀层修饰鱼精蛋白和聚谷氨酸,得到不同表面电荷的碳酸钙微球,在动物水平考察其对免疫细胞活化、细胞因子及抗体分泌水平的影响,结果表明,荷正电的镀层微球诱导更高水平的体液和细胞免疫应答,具有更好的佐剂效果。2)为了进一步制备小粒径碳酸钙微球,在上述最优制备条件基础上,采用了机械搅拌、均质和超声等不同的反应混合方法,在无添加物的情况下成功制得了粒径范围从1 μm到4 μm的碳酸钙微球,抗原装载率高、活性好。体外细胞水平免疫评价显示,与纯抗原和4 μm碳酸钙微球相比,1μm微球更易于被树突状细胞(DCs)摄取,促进DCs的成熟与活化,表达更多的表面共刺激分子CD40和CD83,并分泌更多的细胞因子。同时,1μ 的碳酸钙微球在体内诱导优于铝佐剂的特异性免疫应答,更好地保护机体。3)结合表面电荷和粒径效应的优势,利用超声混合方式和层层自组装镀层,设计制得了表面荷正电的小粒径载抗原碳酸钙微球。与纯抗原和未镀层微球相比,荷正电微球在注射部位停留时间适中,易于被DCs摄取,可提升抗原交叉提呈水平;在体内能够促进B细胞、CD4~+和CD8~+T细胞活化,分泌多种细胞因子、产生高水平抗体、活化细胞毒性T淋巴细胞(CTL),增强特异性免疫反应。4)为了进一步增强碳酸钙微球的佐剂效果,引入免疫刺激剂聚肌胞(Poly I:C),借助其带负电的特性,与鱼精蛋白在载抗原微球表面交替镀层,得到共携载HBsAg和Poly I:C的碳酸钙微球复合佐剂疫苗。细胞和动物水平评价结果显示,与纯抗原组、未添加Poly I:C微球组相比,复合佐剂能够促进DCs成熟和活化,分泌大量炎性细胞因子IL-1β;促进脾细胞增殖以及细胞因子(INF-γ和IL-6)的分泌。复合佐剂组疫苗促进CD8~+ T细胞活化水平分别是纯抗原组、未添加Poly I:C微球组的3倍和2倍,诱导更高水平的CTL活化及杀伤能力,具有高效清除胞内感染的潜力。5)进一步以载抗原碳酸钙微球为模板,在其表面修饰多巴胺,再引入DC靶向分子Anti-DEC205,利用乙二胺四乙酸(EDTA)去除碳酸钙内核,得到装载HBsAg的DC靶向微囊。与纯抗原和碳酸钙微球组相比,DC靶向分子的引入可显著提升DCs对抗原的摄取,促进DCs表面共刺激分子以及MHCⅠ/Ⅱ分子的表达,促进多种细胞因子分泌,产生强有力的免疫记忆。与DC靶向碳酸钙微球相比,微囊能够诱导更高水平的抗原特异性IgG抗体,为机体提供更强的体液免疫保护效果。综上所述,本论文优化了在无添加物情况下利用复分解法制备碳酸钙微球的反应条件,研究了粒径、表面电荷、结合免疫刺激剂及靶向分子等对其佐剂效果的影响,通过合理的组合和设计,可构建安全高效的颗粒型佐剂疫苗,为其临床应用奠定基础。