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背景: 创伤性脑损伤(TBI)后炎性因子无论在继发性损伤的起始或发展阶段都起到了重要的作用,是造成继发性损伤的主要原因之一,高压氧(HBO)治疗减轻继发性损伤。本研究假说认为:HBO治疗改善TBI后大鼠神经功能,其作用机制途径之一是抑制损伤区皮层CCL2-CCR2的表达。 目的: 第一部分:探索CCL2-CCR2对大鼠TBI后神经功能的影响。 第二部分:HBO治疗对TBI大鼠神经功能的作用及可能作用机制。 方法: 第一部分: 1.采用Feeneys自由落体法制备TBI模型。 2.采用平衡木测试评分评估大鼠的平衡功能;网屏实验评价运动功能;水迷宫测试评估大鼠认知功能。 3.采用尼氏染色法显示损伤皮层区神经细胞的形态学变化。 4.用Real-time PCR法检测CCL2 mRNA和CCR2 mRNA的表达。 5.免疫荧光染色检测CCL2、CCR2的免疫阳性细胞变化情况;免疫荧光双标染色检测CCL2、CCR2的细胞定位。 6.采用TUNEL法检测神经细胞的凋亡。 7.采用CCR2拮抗剂药物干预,观察其对神经功能、神经细胞凋亡的影响。 第二部分: 1.采用平衡木测试评分、网屏实验和水迷宫测试观察HBO治疗后TBI大鼠神经功能的变化。 2.观察HBO治疗后脑含水量的变化。 3.采用Real-time PCR法检测HBO治疗后TBI大鼠损伤区皮层CCL2mRNA和CCR2 mRNA的变化。 4.用western blot法检测HBO治疗后CCR2和caspase-3蛋白含量变化。 结果: 第一部分: 1.大鼠脑外伤后运动功能、平衡功能和认知功能较Sham组均明显下降,可持续14d或21d以上。 2.尼氏染色显示损伤皮层区神经元排列稀疏紊乱、细胞间距增大、大量固缩坏死,神经元胞体萎缩、尼氏体减少或消失。 3.Real-time PCR检测显示, TBI术后1-21 d CCL2 mRNA和CCR2 mRNA较Sham组均显著增高,术后3d表达量最大。 4.免疫荧光染色结果显示,与Sham组相比,TBI后1d、3d、7d和10d脑损伤区皮层CCL2和CCR2均表达上调,术后3d为CCL2和CCR2表达的高峰期。 5.免疫荧光双标染色表明大鼠皮层CCL2主要与星形胶质细胞的标记物GFAP共存,表明CCL2主要表达在星形胶质细胞;CCR2主要与神经元的标记物NeuN共存,表明CCR2主要表达在神经元。 6.TBI后1d脑损伤皮层内TUNEL阳性细胞数量最多,其后渐渐下降。与Sham组相比,术后1d、3d、5d和7 d TUNEL阳性细胞数量均显著增多,其中TBI后1d TUNEL阳性细胞数最多。 7.给予CCR2拮抗剂RS504393连续3天后,TBI大鼠神经功能明显改善,损伤区皮层神经细胞凋亡减少。 第二部分: 1.HBO连续治疗3-10d脑损伤大鼠神经功能明显改善。 2.与TBI组相比,TBI+HBO组HBO治疗后术后1d、2d、3d脑含水量明显下降,HBO治疗可以减轻脑水肿。 3.Real-time PCR检测显示,与TBI组相比,TBI+HBO组术后1d、3d、7d和10d损伤区皮层CCL2 mRNA和CCR2 mRNA表达均显著下降。 4.Western blot法检测显示,TBI后1-10 d损伤区皮层CCR2蛋白含量与Sham组相比均增高,术后3 d CCR2蛋白含量较Sham组增加了2.37倍。与TBI组相比,经HBO治疗后,TBI+HBO组术后3d和7 d CCR2蛋白含量均明显下降。 5.Western blot法检测显示, TBI术后1-10d损伤皮层caspase-3蛋白含量与Sham组相比均显著增高,TBI后1 d caspase-3蛋白含量较Sham组增加了3.29倍。经HBO治疗后,与TBI组相比,TBI+HBO组术后1d、3d和7 d caspase-3蛋白含量均显著下降。 结论: 第一部分:大鼠TBI后神经功能下降,损伤皮层区神经细胞凋亡增加,与CCL2和CCR2表达升高有关,CCL2-CCR2通路可能在TBI后神经炎症中发挥了重要作用。 第二部分:HBO治疗后可能通过抑制CCL2和CCR2的表达及它们的相互作用来改善大鼠的神经功能、减轻脑水肿和神经细胞凋亡。