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病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)是由嗜心性病毒感染心肌所致的心肌及其间质的局灶性或弥漫性炎症。是临床和病理实践中最常见的一类心肌炎。是临床常见的心血管系统疾病之一,近年来在成人和青少年中的发病率呈逐年上升趋势。鉴于心肌炎的病因及发病机制尚不完全明了,迄今缺乏特效的治疗方法:许多患者心肌病毒持续感染,免疫功能持续紊乱,病情迁延,常遗留顽固性心律失常、慢性心功能不全甚至进展为扩张性心肌病,治疗上更为棘手。病毒性心肌炎的临床症状常不明显,往往不能引起人们充分的重视,感染波及到心脏传导组织时,可引起病人的突然死亡,其中儿童患病毒性心肌炎预后较差,尤其是婴儿的病死率高达50%。因此,探索VMC的防治策略具有十分重要的理论价值和实践意义。
Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是天然免疫针对病原微生物的一类感受器,在天然免疫中发挥着重要作用,并成为联系适应性免疫的纽带。以往对TLR4的研究大多集中在TLR4对细菌感染的作用。随着研究的深入,近些年来TLR4在抗病毒免疫中的作用也日益受到关注。柯萨奇病毒(coxsackie virus,CV)是VMC最常见的病原体。众多研究表明急性病毒感染可直接损害心肌细胞,是VMC发病的重要机制,因此本实验研究TLR4、NF-κ B信号转导途径在病毒性心肌炎中的表达及意义,希望通过以上研究为病毒性心肌炎发生发病机制提供某方面的参考,为临床治疗提供某些新的途径,为心肌炎猝死的病理学诊断、死因分析提供简便、实用、可行的监测手段和依据。
研究目的:
从病毒性心肌炎病毒被识别的机制入手,研究TLR4、NF-κB信号转导途径及其下游Caspase-3及Mstl在病毒性心肌炎发病机制的作用。运用免疫组化技术及图像分析技术观察TLR4、NF-κB、Caspase-3及Mstl的表达分布情况及分析其相关性。并通过TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测心肌细胞凋亡的情况,并用RT-PCR技术检测TLR4的表达。
材料和方法:
1.研究对象
筛选并收集中山大学法医鉴定中心2004年-2007年的尸体解剖案例中符合要求的30例心脏标本作为实验组。男17例,女13例,年龄在18-65岁。实验组根据Dallas标准分为明确性心肌炎组(15例)和界限性心肌炎组(15例)。
收集广州市殡仪馆2007年由于交通事故死亡后立即解剖的15例正常心脏标本作为对照组,其中男7例,女8例。
实验组:明确性心肌炎 15例界限性心肌炎 15例对照组:正常心肌组 15例。
2.研究方法
2.1 形态学观察:对所收集的标本均进行HE染色并采用免疫组织化学染色(Immunohistochemistry,IHC)检测心肌组织中TLR4、NF-κ B、Caspase-3和Mstl的表达和分布。
2.2 TUNEL细胞凋亡原位检测:对三组样本进行TUNEL细胞凋亡检测,检测心肌细胞凋亡的情况,并分析各组Caspase-3、Mst-1与凋亡指数(AI)的相关性。
2.3 RT-PCR技术:应用RT-PCR技术检测三组样本的TLR4受体的表达情况。
3.统计学分析
采用统计学软件包SPSS13.0进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(-X±s)表示,多组均数比较采用方差分析,P<0.05为有统计学意义;组间变量采用相关分析,P<0.05为有统计学意义。
结果:
1.明确性心肌炎组的TLR4、NF-κ B、Caspase-3、Mst1显著高于界限界限性组、正常心肌组(P<0.05)。
2.界限性心肌炎组的TLR4、NF-κ B、Caspase-3、Mst1显著高于正常心肌组(P<0.05)。
3.明确性心肌炎组TLR4的表达量与NF-κ B的表达量呈显著正相关关系(r=0.624,P<0.05),NF-κ B与Caspase-3的表达量呈显著正相关关系(r=0.649,P<0.05),Caspase-3与Mst1的表达量呈显著正相关关系((r=0.538,P<0.05)。界限性心肌炎组TLR4的表达量与NF-κ B的表达量呈显著正相关关系(r=0.731,P<0.05),NF-κ B与Caspase-3的表达量呈显著正相关关系(r=0.576,P<0.05),Caspase-3与Mst1的表达量呈显著正相关关系((r=0.617,P<0.05)。而正常心肌组织中TLR4的表达量与NF-κ B的表达量呈无相关关系(r=0.174,P>0.05),NF-κ B与Caspase-3的表达量无相关关系(r=0.278,P>0.05),Caspase-3与Mst1的表达量无正相关关系((r=0.189,P>0.05)。
4.TUNEL细胞凋亡原位检测结果:明确性心肌炎与界限性心肌炎组的凋亡指数均升高,两者没有统计学差别(P>0.05)。与正常心肌组相比,明确性心肌炎组与界限性心肌炎组凋亡指数均升高,均有统计学意义(P<0.05)。明确性心肌炎、界限性心肌炎中凋亡指数(AI)与Caspase-3的表达量呈显著正相关关系,Mst1与Caspase-3的表达量呈显著正相关关系,而Mst1与AI无显著相关关系。而正常心肌组凋亡指数(AI)与Caspase-3、Mst1与Caspase-3的表达、Mst1与AI均无显著相关关系。
5.用RT-RCR技术检测TLR4的表达,扩增产物为239bp。
结论:
1.TLR4、NF-κB信号转导途径可能在病毒性心肌炎疾病的发生发展过程中起着重要作用。
2.Caspase-3、Mst1在引起病毒性心肌炎心肌细胞的凋亡过程中发挥重要作用。同时,Caspase-3作为TLR4、NF-κB的信号转导途径的下游进一步证实该信号转导通路在病毒性心肌炎的存在。
3.抑制TLR4和NF-κ B的活化可能成为治疗病毒性心肌炎的一个潜在的、有价值的靶点,为病毒性心肌炎提供新的治疗途径;同时也为法医学鉴定提供科学依据。