研究背景脓毒症是一种由严重感染引起的过度炎症反应的临床综合征。可引起多器官功能障碍综合征(MODS),最终可引起器官衰竭,临床预后差,死亡率高。在脓毒症过程中,肝脏对清除细菌的防御反应和产生炎症介质起着重要的作用。此外,脓毒症引起的多器官损伤和衰竭可能是由于线粒体功能恶化和细胞能量代谢衰竭引起的。线粒体通过提供能量,利用大约98%的全身氧来维持正常的细胞功能。因此,线粒体在维持正常的器官功能中起着重要的作用。另一方面,保持线粒体结构的完整性是正常的线粒体功能及能量代谢必不可少的。脓毒症状态下,主要表现为细胞病理性缺氧,氧利用障碍,导致能量产生下降,而线粒体功能降低是细胞氧利用障碍的根本原因。脓毒症时会出现线粒体结构损伤与功能障碍,线粒体损伤的同时会诱发促炎介质的释放,加重炎症反应,同时线粒体功能障碍导致组织细胞产生能量不足,引起严重的微循环障碍,直至多器官功能衰竭。可见线粒体功能障碍往往与失调的全身炎症反应引起的多器官功能衰竭相关;然而,线粒体功能障碍的确切机制尚不完全清楚。川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是中药川弯的一种活性提取物,广泛应用于抗炎和治疗心血管疾病。TMP可抑制脂质过氧化,作为灭活活性氧、保护酶的抗氧化剂。TMP还具有抗炎和器官保护作用,并在细胞水平上改善线粒体功能。然而,这些影响作用的分子机制仍然不清。水通道蛋白8(Aquaporin-8,AQP8)位于肝细胞内线粒体膜,主要介导水和其他代谢底物的运输,对维持线粒体的正常结构十分必要。AQP8还通过诱导细胞快速肿胀,促进IL-1β释放而介导炎症。另一方面,线粒体敲除AQP8基因能导致氧化剂诱导的线粒体功能障碍和导致人肝肿瘤细胞坏死性死亡。在肿瘤坏死因子α(TNF-α)介导的脓毒症实验动物模型中,肝细胞AQP8的表达可能通过其转录后抑制的机制而被下调,导致AQP8介导的水向线粒体外的转运功能下降,线粒体体积的快速膨胀,线粒体破裂。这些证据表明AQP8可能在维持正常的线粒体功能中起重要的作用。以往的研究表明,川芎嗪可能通过增加AQP8表达保护脓毒症大鼠肝细胞线粒体的结构。然而,TMP能否通过改善线粒体功能保护肝脏免受炎症损害,在脓毒症大鼠模型中AQP8和炎症反应之间是否存在相互影响仍不清楚。在当前的研究中,我们试图进一步探讨TMP对线粒体功能的影响,阐明TMP在治疗脓毒症致急性肝损伤中对线粒体保护作用的潜在机制。方法选用96只SD大鼠,随机分为正常对照组、脓毒症组、TMP治疗组和TMP预防组,每组24只。使用盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)法制备脓毒症实验动物模型,对照组实验动物仅接受假手术处理;脓毒症组进行CLP手术;治疗组在CLP手术完成后,立即从大鼠尾静脉注射盐酸川芎嗪注射液,剂量为60 mg/kg;预防组在CLP手术处理前7天开始每天从大鼠尾静脉注射60 mg/kg盐酸川芎嗪注射液。造模18小时后,在四组大鼠中随机抽取12只处死,留取肝脏和血清标本,部分肝脏组织固定、包埋后保存,余肝脏组织及血清保存在零下80℃C冰箱中。每组剩余12只大鼠观察至出现明显脓毒症症状及至死亡的时间,并绘制生存曲线。生化分析仪直接检测大鼠血清ALT、AST、m-AST的水平。双抗体夹心酶联免疫吸附法检测血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平。提取部分肝脏组织标本,采用ATP检测试剂盒,测定组织中ATP含量。取包埋后的大鼠肝脏制备50nm厚度的电镜切片,使用4%的醋酸铀酰和0.5%的醋酸铅染色后,电镜下观察肝细胞线粒体的超微结构;按照Flameng分级方法对肝脏线粒体进行半定量分析。差速离心法提取肝细胞线粒体,JC-1对线粒体进行染色,激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测荧光强度,通过绿色荧光/红色荧光的比值,间接反映线粒体膜电位变化。取肝细胞线粒体,采用分光光度法,测定线粒体膜Na+-K+-ATP酶、Mg+-ATP酶、Ca2+-ATP 酶、Ca2+-Mg2+-ATP 酶活性。裂解肝细胞线粒体,分离出线粒体内膜蛋白,采用Western blot法检测AQP8蛋白,采用实时定量荧光聚合酶链式反应(Real-time PCR)法检测肝组织AQP8 mRNA的表达。使用SPSS 14.0统计学软件包进行统计学分析。各组大鼠实验结束至出现脓毒症症状的时间、大鼠存活时间,大鼠血清ALT、AST、m-AST的水平,血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平,大鼠肝细胞ATP含量,肝细胞线粒体膜ATP酶活性,AQP8 mRNA表达、AQP8蛋白表达使用均数士标准差(x± s)表示,组间比较采用方差分析(ANOVA)进行处理;AQP8蛋白表达与血清 ALT、AST、m-AST,肝细胞 ATP 含量,血清 IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平的相关性分析使直线相关性检验。结果1.大鼠手术结束至出现脓毒症症状的时间和存活时间脓毒症组大鼠手术结束至出现症状的时间较治疗组和预防组短(P<0.01);治疗组和预防组的大鼠存活时间较脓毒症组长(P<0.01);治疗组和预防组两组大鼠出现脓毒症症状的时间和存活时间均无显著差异(P>0.05)。2.肝脏组织中ATP含量及血清ALT、AST、m-AST的水平与正常对照组相比,脓毒症组大鼠肝脏组织中ATP含量明显减低(P<0.01);与脓毒症组比较,治疗组和预防组肝脏组织中ATP含量升高(P<0.01)。与正常对照组比较,脓毒症组血清ALT、AST、m-AST的水平明显升高(P<0.01);与脓毒症组相比,治疗组和预防组血清ALT、AST、m-AST的水平降低(P<0.01)。3.肝细胞线粒体结构的变化电镜观察大鼠肝细胞线粒体发现脓毒症组线粒体体积增大,嵴明显肿胀、并有空泡样变,外膜破裂,线粒体内出现脂肪变性。而在治疗组和预防组,大鼠肝细胞线粒体上述变化,如肿胀、空泡样改变等均较脓毒症组减轻。脓毒症组肝脏线粒体电镜半定量评分较对照组明显增加(P<0.01);TMP治疗组和预防组肝脏线粒体电镜半定量评分较脓毒症组明显降低(P<0.01)。4.肝脏细胞线粒体膜电位激光共聚焦及流式细胞仪检测肝脏线粒体膜电位结果表明:脓毒症组大鼠肝脏线粒体膜电位明显低于对照组(P<0.01),而治疗组和预防组大鼠肝细胞线粒体膜电位高于脓毒症组(P<0.01)。5.肝脏细胞线粒体ATP酶活性与对照组比较,脓毒症组肝细胞线粒体Na+-K+-ATP酶、Mg+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性水平明显下降(P<0.01),与脓毒症组相比,治疗组和预防组肝细胞线粒体Na+-K+-ATP酶、Mg+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶活性明显升高(P<0.01)。而治疗组和预防组之间则没有显著性差异(P>0.05)。6.肝细胞线粒体AQP8 mRNA的表达与对照组比较,脓毒症组大鼠肝细胞线粒体AQP8 mRNA的表达降低(P<0.01);脓毒症组线粒体AQP8 mRNA的表达低于治疗组和预防组的(P<0.01);而治疗组和预防组之间则没有显著性差异(P>0.05)。7.肝细胞线粒体AQP8蛋白的表达与对照组比较,肝细胞线粒体AQP8蛋白的相对表达量在脓毒症组明显减少(P<0.01);治疗组和预防组的AQP8蛋白相对表达量较脓毒症组升高(P<0.01),在治疗组和预防组之间则没有显著性差异(P>0.05)。8.血清炎症因子水平与对照组比较,脓毒症组大鼠血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平显著增加(P<0.01),而TMP治疗组及预防组大鼠血清IL-1β、IL-6、HGMB1、TNF-α和NO水平低于脓毒症组(P<0.01)。9.相关性分析大鼠肝细胞线粒体AQP8蛋白的表达与血清ALT、AST、m-AST的水平呈负相关(P<0.01),大鼠肝细胞线粒体AQP8蛋白的表达量与肝细胞ATP含量、线粒体膜电位水平呈正相关(P<0.01)。大鼠肝细胞线粒体AQP8蛋白的表达与血清NO、TNF-α水平负相关(P<0.01)。结论1.川芎嗪可以延缓大鼠CLP手术后出现脓毒症症状的时间,延长脓毒症大鼠的生存时间。2.脓毒症大鼠血清炎症因子释放增加,肝细胞线粒体AQP8、AQP8 mRNA表达下降、并出现肝细胞ATP含量下降、线粒体ATP酶活性下降、线粒体膜电位下降等线粒体功能障碍,同时线粒体结构变化,还出现肝功能损害。而线粒体AQP8蛋白的表达与肝脏酶学指标的呈负相关,与肝细胞ATP含量及线粒体膜电位呈正相关,与血清TNF-α、NO水平呈负相关。3.川芎嗪能改善脓毒症大鼠的肝功能,保护肝细胞线粒体功能,其机制可能包括:(1)川芎嗪可以通过上调线粒体AQP8蛋白的表达、保护线粒体ATP酶活性,稳定线粒体膜电位来发挥对脓毒症大鼠肝线粒体损伤的保护作用。(2)川芎嗪可以抑制TNF-a、IL-1β、IL-6、HGMB1、NO等多种炎症介质的过量释放,从而抑制脓毒症发生时失控的炎症反应。