D-乳酸脱氢酶的筛选及其生产D-丹参素的应用

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丹参素(D-DSS)是中草药丹参特有的水溶性酚酸类化合物。大量研究表明,它具有广泛的生理药理学活性,临床上主要应用于扩张冠状动脉,抑制血小板凝集和心肌细胞凋亡,抗血栓形成,抗动脉粥样硬化,抗癌,抗炎,保护肝脏和增强免疫等。目前D-DSS的产量远远无法满足临床的需要,所以寻找高产量,高纯度的D-DSS的制备方法成为本研究的重点。本论文使用酶转化法来制备D-DSS,筛选D-DSS产量较高的D-乳酸脱氢酶(D-LDH)并进行了酶学性质的研究。同时研究了D-LDH和葡萄糖脱氢酶(GDH)共表达来实现辅酶的再生,利用全细胞催化产D-DSS。主要研究结果如下:(1)用实验室保藏的19株乳酸菌来催化3,4-二羟基苯丙酮酸(DPA)产D-DSS,比较它们各自转化生成D-DSS的产量,其中产量最高的菌株是罗伊氏乳杆菌Lactobacillus reuteri JN516。(2)对L.reuteri JN516的D-LDH进行分析,将预测的四个D-乳酸脱氢酶的基因分别命为d-ldh83871,d-ldh82948,d-ldh82319和d-ldh83931。将这些基因进行引物设计和分子克隆,与载体pColdII相连,然后在E.coli BL21(DE3)中低温诱导表达。发现D-LDH82319还原DPA活性较高。通过预测D-LDH82319的分子量为35 kDa,并且其催化生成的D-DSS的光学纯度达到100%。D-LDH82319的酶学性质:最适温度和pH分别为25°C和8.0;其对丙酮酸的催化活性较高;Ca2+和Ni2+促进其酶活,而Cu2+抑制酶活;当以NADH为辅酶时,D-LDH82319对于DPA有着最大亲和力(Km=0.09 mmol·L-1),同时以NADPH为辅酶时,D-LDH82319对于DPA有着最大亲和力(Km=0.10 mmol·L-1),因此表明D-LDH82319具有辅酶非特异性。(3)将D-LDH82319和来自Bacillus subtilis ATCC 13952的GDH(28 kDa)共表达,构建菌株E.coliBL21(DE3)/pColdⅡ-d-ldh82319-T7-gdh和E.coli BL21(DE3)/pColdII-gdh-T7-d-ldh82319,实现辅酶的再生。比较两种共表达菌株生成D-DSS的产量,结果表明:E.coli BL21(DE3)/pColdⅡ-d-ldh82319-T7-gdh的全细胞转化生成D-DSS产量较高,产量为15.6 g·L-1。(4)优化全细胞催化合成D-DSS的条件,最适转化条件:底物DPA浓度为2 g·L-1,葡萄糖浓度为1.5 g·L-1,温度为25°C,pH 8.0。在此条件下转化4 h,转化率最高可以达到95.93%。
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