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研究背景
抑郁症(Depression)是一种常见并且严重的神经障碍类疾病，临床表现为持续的情绪低落、思维迟缓和生活无意义感。而重症抑郁症患者甚至会产生自杀的倾向，严重危害人类健康。目前抑郁症的治疗主要以药物缓解为主，已有的抗抑郁药物(选择性5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)再摄取抑制剂、5-羟色胺-去甲肾上腺素(noradrenaline，NE)再摄取抑制剂)主要通过提升突触间隙兴奋性神经递质的浓度发挥抗抑郁作用。但普遍存在见效时间长、副作用大以及人群药物敏感性差异大等问题。因此，揭示新的抑郁症发病机制和寻找新靶标，对抗抑郁药物研发和疾病的治疗有重要价值。
程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)是一个重要的蛋白质翻译抑制因子。已有研究表明PDCD4直接或间接调控细胞约1/3蛋白的表达，参与细胞因子表达调控及细胞生长、代谢等多个过程。我们实验室长期从事PDCD4与疾病的关系和分子机制研究，已发现PDCD4可通过负向调控不同的靶分子参与肿瘤、脂质代谢(动脉粥样硬化和肥胖)等多种疾病的发生与发展。更重要的是最近我们意外发现PDCD4与抑郁症的发生密切相关:1)PDCD4在抑郁症病人海马脑区(hippocampus，HIP)高表达，慢性束缚应激(chronic restraint stress，CRS)诱导抑郁症时可上调小鼠HIP中PDCD4的表达;2)PDCD4敲除小鼠能够抵抗CRS诱导的抑郁样行为，而于HIP过表达PDCD4，小鼠可出现自发性抑郁样行为;3)分子机制探索中我们发现PDCD4主要通过结合蛋白质翻译起始因子4A(eukaryotic initiation factor 4A，eIF4A)进而抑制脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)翻译的起始促进抑郁症的发展。这些结果表明PDCD4是诱导抑郁症发生的新基因，可能成为抗抑郁药物研发的新靶点并为新型抗抑郁药物的设计和研究奠定理论基础。
本文的目的是在已有研究的基础上，以PDCD4为靶点、以PDCD4调控BDNF表达的分子机制为理论基础。利用小干扰RNA沉默PDCD4表达、利用干扰肽和小分子化合物干扰PDCD4与下游靶基因的相互作用。设计、筛选和制备相关药物并通过体外细胞模型和CRS诱导的小鼠抑郁模型，分析这些候选药物对PDCD4下游靶分子BDNF表达的影响以及在抑郁症治疗中的作用，为新型抗抑郁药物的研发奠定基础。
本项目的研究内容包括以下三个方面:
一、PDCD4特异性小干扰RNA制备、修饰及抗抑郁作用研究;
二、PDCD4干扰多肽的筛选、制备及抗抑郁作用研究;
三、PDCD4配体小分子的筛选及抗抑郁作用研究。
研究方法
一、PDCD4特异性小干扰RNA(siPdcd4)制备、修饰及抗抑郁作用研究
1.PDCD4小干扰RNA的制备及其对神经细胞BDNF表达影响
(1)筛选PDCD4的特异性小干扰RNA(siPdcd4)，转染细胞，采用RT-PCR和免疫印迹检测siPdcd4的沉默效率;
(2)脂质体法将siPdcd4转染至神经细胞，24h后免疫印迹检测其对PDCD4下游靶基因BDNF表达的影响。
2.探究PDCD4小干扰RNA对小胶质细胞炎性细胞因子表达的影响
(1)脂质体法将siPdcd4转染至小胶质细胞，24h后添加LPS和ATP刺激，收取不同时间梯度的细胞培养上清和总RNA;
(2)RT-PCR和ELISA检测siPdcd4对小胶质细胞炎性细胞因子(IL-6、IL-1β)表达的影响。
3.siPdcd4神经靶向修饰和干扰效率检测
(1)合成狂犬病毒糖蛋白靶向运输多肽(RVG-9dR);
(2)体外将Cy5荧光素标记的siPdcd4(Cy5-siPdcd4)进行神经靶向运输修饰(RVG/Cy5-siPdcd4);
(3)RVG/Cy5-siPdcd4处理神经细胞，高内涵成像检测红色荧光信号在细胞内的分布;
(4)RVG/Cy5-siPdcd4处理神经细胞48h后，RT-PCR和免疫印迹检测神经细胞中PDCD4表达变化。
4.神经细胞mTORC1失活时RVG/siPdcd4对BDNF表达的影响
(1)mTORC1特异性抑制剂rapamycin阻断神经细胞mTORC1信号通路，免疫印记检测不同时间梯度BDNF和PDCD4表达的变化;
(2)RVG/siPdcd4沉默神经细胞内源性PDCD4，24h后，添加rapamycin阻断mTORC1信号通路，免疫印迹检测RVG/siPdcd4对BDNF表达的影响。
5.检测RVG/siPdcd4能否跨过血脑屏障靶向入脑及对PDCD4和BDNF表达的影响
(1)将50μgRVG/Cy5-siPdcd4通过尾静脉注射至小鼠体内，6h、24h、48h、和72h分别通过小动物活体成像系统检测红色荧光在体内的分布;
(2)RT-PCR和免疫印迹检测海马区和前额叶皮质PDCD4的沉默效率和BDNF表达变化;
(3)RVG/siPdcd4浓度梯度实验，通过PDCD4的沉默效率和BDNF的表达变化确定体内实验最优RVG/siPdcd4使用浓度。
6.行为学评价RVG/siPdcd4对CRS诱导的抑郁样行为的影响
(1)慢性束缚应激诱导小鼠抑郁模型。将RVG/siPdcd4通过尾静脉注射至小鼠体内，RT-PCR检测海马区和前额叶皮质中PDCD4的沉默效率，免疫印迹和ELISA检测海马中BDNF表达的变化;
(2)ELISA检测海马和外周血中炎性细胞因子表达的变化，明确RVG/siPdcd4对抑郁症炎性水平的影响;
(3)脑组织进行高尔基染色，通过神经元树突棘密度评价神经突触可塑性的改变;
(4)通过悬尾实验、强迫游泳实验和蔗糖水偏好实验评价RVG/siPdcd4对小鼠抑郁样行为的影响。
二、PDCD4干扰多肽的筛选、制备及抗抑郁作用研究
1.筛选特异性干扰PDCD4与eIF4A结合的氨基酸序列
(1)构建eIF4A-HA、PDCD4-FLAG和BDNF-GFP过表达载体;
(2)查阅文献和蛋白结构数据库找到PDCD4与eIF4A相互作用的关键氨基酸位点及主要作用结构域(氨基酸序列);
(3)利用分子克隆构建关键结构域(氨基酸序列)与GFP的融合蛋白表达载体;
(4)通过免疫共沉淀和免疫印迹实验，筛选能够特异性干扰PDCD4与eIF4A结合并且上调BDNF的表达的结构域(氨基酸序列);
(5)将筛选的氨基酸序列与跨膜序列相偶联(N端)，合成相应的干扰多肽。
2.干扰多肽对PDCD4与eIF4A结合的影响
(1)免疫荧光实验检测干扰多肽的跨膜效率、细胞内稳定性以及与PDCD4蛋白的结合情况;
(2)免疫共沉淀及双荧光分子互补实验，检测干扰多肽对PDCD4和eIF4A结合的影响。
3.干扰多肽对BDNF表达的影响
(1)将PDCD4-FLAG和BDNF-GFP共同过表达于HEK-293细胞，免疫印迹检测干扰多肽对BDNF表达的影响;
(2)免疫印迹及ELISA实验检测干扰多肽对神经细胞BDNF表达的影响;
(3)ELISA检测神经细胞培养上清中分泌性BDNF和炎性细胞因子表达的变化。
4.神经细胞mTORC1失活时干扰多肽对BDNF表达的影响
在原代海马神经元mTORC1信号通路完全阻断的情况下，免疫印迹检测干扰多肽对神经元内源性BDNF表达的影响。
5.海马定点注射干扰多肽对CRS诱导的焦虑及抑郁样行为的影响
(1)野生型4-6周龄C57BL/6J雄性小鼠，慢性束缚应激诱导抑郁模型;
(2)根据小鼠冠状脑图谱，于海马脑区腹侧埋下微型给药管，免疫荧光检测干扰多肽在海马组织中的扩散情况;
(3)于抑郁小鼠海马区定点注射干扰多肽，治疗完成后免疫印迹实验和ELISA检测BDNF表达的变化;
(4)小鼠脑组织进行高尔基染色，统计分析海马神经元轴突树突棘密度，评价干扰多肽对神经突触可塑性的影响;
(5)干扰多肽治疗结束后进行行为学检测，评价干扰多肽对小鼠焦虑及抑郁样行为的影响。
三、PDCD4配体小分子的筛选及抗抑郁作用研究
1.PDCD4配体小分子的筛选
基于高斯过程的定量结构-活性关系回归预测(Gaussian process-based QSAR)在类药物生物源化合物文库中进行高通量虚拟筛选。根据与靶蛋白的主要结合位置，筛选在微摩尔水平上与PDCD4蛋白具有高或中等亲和力的小分子化合物。
2.PDCD4配体小分子功能检测
(1)免疫共沉淀实验检测PDCD4配体小分子对PDCD4与eIF4A结合的影响;
(2)免疫印迹实验检测PDCD4配体小分子对神经细胞BDNF表达的影响;
(3)将PDCD4-FALG和BDNF-GFP过表达载体共同转染至HEK-293细胞，免疫印迹检测PDCD4过表达时PDCD4配体小分子对BDNF表达的影响;
(4)免疫印迹检测神经细胞mTORC1失活时PDCD4配体小分子对BDNF的表达影响。
3.PDCD4配体小分子对CRS诱导的抑郁样行为的影响
(1)慢性束缚应激诱导小鼠抑郁模型，将不同浓度的PDCD4配体小分子通过腹腔注射至小鼠体内。免疫印迹实验和ELISA检测抑郁小鼠海马和前额叶皮质BDNF表达的变化;
(2)脑组织进行高尔基染色，通过神经元轴突树突棘密度评价神经突触可塑性的变化;
(3)对小鼠进行行为学检测评价PDCD4配体小分子对抑郁样行为的影响。
结果
一、PDCD4特异性小干扰RNA制备、修饰及抗抑郁作用研究
前期研究结果显示抑郁症患者海马区PDCD4表达升高，于海马区过表达PDCD4后野生型小鼠出现自发抑郁样行为。而PDCD4敲除小鼠则完全抵抗慢性束缚应激导致的抑郁行为的产生，提示PDCD4是治疗抑郁症的重要靶点。为此，本部分利用PDCD4小干扰RNA干扰中枢神经系统PDCD4的表达，研究其抑郁症的治疗效应。
(一)siPdcd4干扰效率检测及其对PDCD4下游靶基因表达的影响
(1)首先通过对PDCD4的mRNA核酸序列进行分析，从核酸数据库筛选、合成了PDCD4小干扰RNA(siPdcd4)，并通过细胞学实验证明能有效沉默PDCD4的表达。
(2)siPdcd4对BDNF表达的影响:通过脂质体法将siPdcd4转染至神经细胞，免疫印迹实验检测siPdcd4对下游靶基因BDNF表达的影响。结果显示siPdcd4沉默PDCD4后可明显上调神经细胞BDNF的表达。
(3)siPdcd4对炎性细胞因子表达的影响:PDCD4不仅可抑制BDNF，而且可负向调控促炎性细胞因子的表达。因此，我们进一步探究siPdcd4对小胶质细胞炎性细胞因子表达的影响，结果显示siPdcd4能够明显抑制LPS和ATP刺激诱导的IL-6和IL-1β的表达。
(二)siPdcd4神经细胞靶向修饰及特异性检测
(1)siPdcd4神经细胞靶向修饰:为了解决siPdcd4静脉注射不能通过血脑屏障入脑的技术瓶颈，我们合成了嗜神经的狂犬病毒糖蛋白多肽(RVG-9dR)。已经证明RVG-9dR多肽的9个D-精氨酸通过电荷相吸与siPdcd4结合，能够对siPdcd4进行神经靶向修饰(RVG/siPdcd4)。另外，为了便于体内示踪，采用Cy5荧光素(红色)对siPdcd4进行了标记(Cy5-siPdcd4)，制备了既具有神经特异性又可示踪的RVG/Cy5-siPdcd4复合物。
(2)RVG/siPdcd4神经细胞靶向的特异性检测:为了检测RVG-9dR修饰后的siPdcd4(RVG/siPdcd4)神经靶向特异性，我们用RVG/Cy5-siPdcd4分别去处理具有乙酰胆碱受体的神经细胞(SH-SY5Y、HT-22)和小胶质细胞(BV2)以及不表达乙酰胆碱受体的非神经细胞Hela。通过高内涵成像系统检测Cy5-siPdcd4在细胞的分布，结果显示，神经细胞SH-SY5Y、HT-22和BV2的细胞浆中均能够观察到带红色荧光的siPdcd4，而非神经细胞Hela的细胞浆中无明显红色荧光信号。
(3)沉默效率检测:RT-PCR和免疫印迹结果显示RVG/siPdcd4能够在转录和翻译水平沉默神经细胞SH-SY5Y、HT-22和BV2内源性PDCD4的表达，而对非神经细胞Hela的PDCD4无明显沉默作用。
以上结果表明，RVG-9dR多肽修饰的siPdcd4(RVG/siPdcd4)特异性进入神经细胞并且沉默PDCD4的表达。
(三)RVG/siPdcd4逆转神经细胞mTORC1失活对BDNF的抑制作用
我们前期机制研究发现，抑郁症时脑内PDCD4表达升高是由于mTORC1活性降低导致PDCD4磷酸化-泛素化降解途径受阻的结果。故我们用mTORC1特异性抑制剂rapamycin去抑制海马神经元细胞HT-22和小胶质细胞BV2的mTORC1活性，建立模拟抑郁小鼠脑内变化的细胞模型。我们发现与体内结果一致mTORC1被抑制后PDCD4出现累积，BDNF的表达受到明显抑制。在相同的实验体系下，我们发现RVG/siPdcd4能够逆转神经细胞mTORC1失活对BDNF的抑制作用。
(四)RVG/siPdcd4能够跨过血脑屏障靶向入脑
为了检测RVG-9dR能否携带siRNA跨过血脑屏障。我们将RVG/Cy5-siPdcd4通过尾静脉注射至小鼠体内，通过活体成像系统进行体内示踪。结果显示6h时RVG/Cy5-siPdcd4已经由外周输运至脑组织但是进入剂量较少，此时Cy5-siPdcd4主要存在于小鼠的腹部。而24h时RVG/Cy5-siPdcd4则主要聚集于脑内，腹部无明显荧光。48h时脑内红色荧光依然存在但是与24h相比明显减弱。72h时脑内无可检测到的红色荧光信号。上述结果提示RVG/Cy5-siPdcd4能够跨过血脑屏障靶向入脑并且具有良好的稳定性。与此同时，在RVG/siPdcd4注射48h后通过RT-PCR和免疫印迹实验检测了海马和前额叶皮质中BDNF的表达变化。结果显示RVG/siPdcd4注射至小鼠体内通过沉默海马和前额叶皮质中的PDCD4上调BDNF的表达。
(五)静脉注射RVG/siPdcd4可治疗慢性束缚应激诱导的抑郁症
为了探究RVG/siPdcd4对抑郁症的治疗效果，慢性束缚应激诱导小鼠抑郁模型。诱导成功后通过尾静脉注射RVG/siPdcd4进行抗抑郁治疗:
(1)RT-PCR和免疫印迹实验结果显示，RVG/siPdcd4能有效沉默抑郁小鼠海马和前额叶皮质中的PDCD4、降低促炎性细胞因子IL-6和IL-1β表达并显著提升BDNF的表达;
(2)脑组织高尔基染色实验结果显示，RVG/siPdcd4可增加海马神经元轴突树突棘的密度，改善神经突触可塑性;
(3)行为学检测结果表明，RVG/siPdcd4能够降低悬尾实验、强迫游泳实验小鼠的不动时间，增加抑郁小鼠的蔗糖水偏好指数。
以上结果表明，RVG/siPdcd4通过沉默PDCD4、抑制促炎细胞因子IL-6和IL-1β的表达、上调BDNF的表达和修复神经突触可塑性治疗CRS诱导的抑郁症。
二、PDCD4干扰多肽的筛选、制备及抗抑郁作用研究
前期机制的探索发现PDCD4通过结合eIF4A进而抑制BDNF的翻译促进抑郁症的发展。提示，如果干扰PDCD4和eIF4A的结合将解除PDCD4对BDNF的抑制作用进而治疗抑郁症。因此本部分根据PDCD4和eIF4A结合的位点筛选能够干扰二者相互作用的干扰多肽并对其抗抑郁作用进行研究。
(一)eIF4A结合PDCD4关键序列的筛选
通过分析已有的研究结果我们发现eIF4A的P56、K83、G137、T159和R360是eIF4A与PDCD4结合的关键氨基酸位点。根据氨基酸位点所在位置我们设计了4段可能结合PDCD4的序列，分别命名为eIF4A-Q、eIF4A-I、eIF4A-Ia和eIF4A-VI。为了验证各个氨基酸序列的功能，我们构建了eIF4A-Q、eIF4A-I、eIF4A-Ia和eIF4A-VI与GFP的融合蛋白表达载体，采用免疫共沉淀和免疫印迹实验确定这些基序对PDCD4与eIF4A结合的影响。结果显示，eIF4A-VI干扰PDCD4与eIF4A结合的能力最强，并且能明显上调BDNF的表达。而eIF4A-Q、eIF4A-I和eIF4A-Ia虽然能够干扰PDCD4与eIF4A的结合，但是对BDNF的表达有明显的抑制作用。因此，eIF4A-VI成为后续研究的候选序列。
(二)eIF4A-VI的跨膜修饰及其对PDCD4与eIF4A结合的影响
由于PDCD4与eIF4A的结合主要发生于细胞浆内。为了使筛选的序列进入细胞发挥作用，将具有跨膜效应的9个精氨酸(9 Arginine)偶联在eIF4A-VI的N端，合成了具有跨膜特性的9R-eIF4A-VI干扰多肽。另外，为了证明9R-eIF4A-VI干扰多肽的特异性，我们将363号氨基酸由R363突变为Q363合成了突变多肽Mu-9R-eIF4A-VI作为对照。免疫荧光结果表明，干扰多肽能在1h内跨过细胞膜进入细胞浆并在细胞内能够稳定存在48h，进一步研究发现9R-eIF4A-VI干扰多肽与PDCD4蛋白存在明显的共定位。与此同时，免疫共沉淀与双荧光分子互补实验结果表明9R-eIF4A-VI干扰多肽能够显著干扰PDCD4与eIF4A的结合，但相同的突变多肽Mu-9R-eIF4A-VI却无此效应。以上结果表明9R-eIF4A-VI干扰多肽通过靶向PDCD4特异性干扰PDCD4与eIF4A的结合。
(三)干扰多肽特异性上调BDNF的表达
将PDCD4-FLAG和BDNF-GFP过表达载体按照3∶1的质量比共转染于HEK-293细胞，6h后添加9R-eIF4A-VI干扰多肽，免疫印迹实验检测BDNF表达的变化。结果表明，9R-eIF4A-VI干扰多肽能够逆转PDCD4过表达对BDNF的抑制作用，但相同浓度的Mu-9R-eIF4A-VI多肽对BDNF表达的上调作用消失。为了明确干扰多肽对神经细胞内源性BDNF表达的影响。不同浓度的9R-eIF4A-VI干扰多肽处理神经细胞(原代海马神经元、小鼠海马神经元细胞HT-22和小胶质BV2)。免疫印迹结果表明9R-eIF4A-VI干扰多肽能够显著上调神经细胞内源性BDNF的表达。与此同时，通过炎性细胞因子的表达水平评价了9R-eIF4A-VI干扰多肽对神经细胞的副反应。ELISA结果显示，9R-eIF4A-VI干扰多肽并不会诱发炎性相关细胞因子IL-6和IL-10表达上调。
(四)干扰多肽逆转海马神经元mTORC1失活对BDNF的抑制作用
在前期的工作中，我们在海马神经细胞系和小胶质细胞中用mTORC1活性抑制剂成功构建了模拟抑郁小鼠脑内变化的细胞模型。为了探究9R-eIF4A-VI干扰多肽对神经元BDNF表达的影响，我们用rapamycin去抑制原代海马神经元mTORC1的活性。我们发现与前期结果一致，mTORC1失活后PDCD4出现累积，BDNF的表达受到明显抑制。而9R-eIF4A-VI干扰多肽能够逆转原代海马神经元mTORC1失活对BDNF的抑制作用。
(五)海马区注射干扰多肽能够缓解CRS诱导的焦虑和抑郁样行为
为了检测9R-eIF4A-VI干扰多肽对焦虑和抑郁样行为的影响。通过CRS诱导小鼠抑郁模型，模型构建成功后，通过脑立体定位将9R-eIF4A-VI干扰多肽定点注射至抑郁小鼠的海马区:
(1)脑组织免疫荧光结果显示干扰多肽能够通过定位注射扩散至整个海马组织;
(2)免疫印迹实验和ELISA结果显示干扰多肽能够显著上调抑郁小鼠海马中BDNF的表达;
(3)脑组织高尔基染色结果表明干扰多肽通过增加神经元突触棘密度，改善神经突触可塑性;
(4)行为学结果显示，干扰多肽治疗组小鼠在悬尾实验、强迫游泳实验中与CRS组相比不动时间明显减少。蔗糖水偏好实验中干扰多肽治疗组小鼠蔗糖水偏好指数明显高于CRS组。旷场实验和高架十字实验干扰多肽治疗组小鼠中央区的停留时间显著低于CRS组。
以上结果表明，海马区定点注射9R-eIF4A-VI干扰多肽通过上调BDNF表达、改善神经突触可塑性，缓解CRS诱导的焦虑和抑郁样行为。
三、PDCD4配体小分子的筛选及抗抑郁作用研究
尽管干扰多肽和siRNA药物有特异性高、免疫原性低等优势，但制备成本高、不能口服用药，将来临床应用会受到一定限制。为了克服这种不足，在本部分研究工作中，我们主要探索PDCD4配体小分子化合物治疗抑郁症的可行性
(一)PDCD4配体小分子的筛选
已有研究报道，通过高通量虚拟筛选从类药物小分子文库中筛选了6种可能与PDCD4结合的小分子化合物。进一步研究发现，一种小分子化合物与PDCD4具有高亲和力，另一种小分子与PDCD4具有中等亲和力。模拟结果显示这两种化合物主要通过氢键和π-π键与PDCD4C端MA-3结构域的氨基酸相连接，但是结合后的功能尚不清楚。故本课题选择这两种小分子为候选化合物(分别命名为ZHJ-204和ZHJ-690)检测其对PDCD4靶分子BDNF表达的影响。
(二)PDCD4配体小分子对BDNF表达的影响
(1)首先，我们检测了小分子ZHJ-204和ZHJ-690对神经细胞内源性BDNF表达的影响，结果显示10pM至1nM的ZHJ-204和ZHJ-690能显著上调HT-22和BV2BDNF的表达，并且具有浓度依赖性;
(2)神经细胞mTORC1失活体外抑郁模型结果表明，ZHJ-204和ZHJ-690能够解除rapamycin对BDNF的抑制作用，而且小分子ZHJ-204相较于ZHJ-690对BDNF的上调作用更为显著;
(3)在PDCD4过表达模型中，我们发现小分子ZHJ-204和ZHJ-690能够逆转PDCD4过表达对BDNF的抑制作用。
以上结果表明，PDCD4配体小分子ZHJ-204和ZHJ-690能够上调BDNF的表达。
(三)PDCD4配体小分子抗抑郁作用研究
通过CRS诱导小鼠抑郁模型，诱导完成后进行配体小分子的干预治疗。我们将不同浓度的配体小分子通过腹腔注射至小鼠体内，对照组注射等量的生理盐水，每天注射一次共10次，治疗完成后进行抑郁行为学评价和脑组织生化标志物分析。
(1)首先，我们检测了抑郁症相关脑区海马和前额叶皮质中BDNF表达的变化。免疫印迹结果显示，持续的CRS能够降低海马和前额叶皮质中BDNF的含量，而ZHJ-204(5mg/kg)的治疗能够显著上调抑郁小鼠海马和前额叶皮质中BDNF的表达。
(2)行为学结果表明，ZHJ-204(5mg/kg)治疗组小鼠在悬尾实验和强迫游泳实验中不动时间与CRS组相比显著降低。蔗糖水偏好实验结果显示ZHJ-204(5mg/kg)治疗组小鼠蔗糖水偏好指数明显高于CRS组。
以上结果表明，腹腔注射PDCD4配体小分子ZHJ-204通过上调BDNF的表达缓解CRS诱导的抑郁样行为。
结论
1.神经靶向修饰的PDCD4小干扰RNA(RVG/siPdcd4)通过特异性沉默PDCD4、抑制促炎性细胞因子表达、上调BDNF表达、改善神经突触可塑性治疗CRS诱导的抑郁症。
2.海马定位注射特异性干扰PDCD4与eIF4A结合的9R-eIF4A-VI干扰多肽，通过上调BDNF的表达缓解CRS诱导的焦虑和抑郁样行为。
3.腹腔注射PDCD4配体小分子ZHJ-204通过上调海马和前额叶皮质中BDNF的表达缓解CRS诱导的抑郁样行为。
创新性及意义
1.我们首次将小核酸药物用于抑郁症的治疗，并且通过体外修饰解决了siRNA神经靶向问题。并且发现经过脑内靶向修饰的siPdcd4(RVG/siPdcd4)通过静脉注射能够缓解CRS诱导的抑郁样行为，RVG/siPdcd4有可能成为新的抗抑郁药物。
2.在多肽类抗抑郁药物的研究中，我们筛选并设计了能特异性干扰PDCD4与eIF4A结合的9R-eIF4A-VI干扰多肽。体内实验证明海马定点注射9R-eIF4A-VI干扰多肽能够缓解CRS诱导的焦虑和抑郁样行为。进一步证明了PDCD4促进抑郁症的分子机制并为抗抑郁药物的研究提供了新的策略，同时为干扰多肽类的抗抑郁药物的研发奠定了基础。
3.在小分子类抗抑郁药的研究中，我们从类药物小分子文库中筛选了PDCD4的配体小分子，并且证明了腹腔注射PDCD4配体小分子ZHJ-204通过上调BDNF的表达缓解CRS诱导的抑郁样行为。我们的工作为研究新型小分子抗抑郁药物提供了前期工作基础。
局限性
1.RVG/siPdcd4药代动力学，药物安全评价等相关研究尚未完成。
2.尽管脑内注射9R-eIF4A-VI干扰多肽显现出明显的抗抑郁效应，但外周用药的修饰和效应尚需进一步研究。
3.虽然已经证明PDCD4配体小分子有一定抗抑郁作用，但仍需要对小分子化合物进行进一步的改造和修饰，以便提高其活性和成药性。
抑郁症(Depression)是一种常见并且严重的神经障碍类疾病，临床表现为持续的情绪低落、思维迟缓和生活无意义感。而重症抑郁症患者甚至会产生自杀的倾向，严重危害人类健康。目前抑郁症的治疗主要以药物缓解为主，已有的抗抑郁药物(选择性5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)再摄取抑制剂、5-羟色胺-去甲肾上腺素(noradrenaline，NE)再摄取抑制剂)主要通过提升突触间隙兴奋性神经递质的浓度发挥抗抑郁作用。但普遍存在见效时间长、副作用大以及人群药物敏感性差异大等问题。因此，揭示新的抑郁症发病机制和寻找新靶标，对抗抑郁药物研发和疾病的治疗有重要价值。
程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)是一个重要的蛋白质翻译抑制因子。已有研究表明PDCD4直接或间接调控细胞约1/3蛋白的表达，参与细胞因子表达调控及细胞生长、代谢等多个过程。我们实验室长期从事PDCD4与疾病的关系和分子机制研究，已发现PDCD4可通过负向调控不同的靶分子参与肿瘤、脂质代谢(动脉粥样硬化和肥胖)等多种疾病的发生与发展。更重要的是最近我们意外发现PDCD4与抑郁症的发生密切相关:1)PDCD4在抑郁症病人海马脑区(hippocampus，HIP)高表达，慢性束缚应激(chronic restraint stress，CRS)诱导抑郁症时可上调小鼠HIP中PDCD4的表达;2)PDCD4敲除小鼠能够抵抗CRS诱导的抑郁样行为，而于HIP过表达PDCD4，小鼠可出现自发性抑郁样行为;3)分子机制探索中我们发现PDCD4主要通过结合蛋白质翻译起始因子4A(eukaryotic initiation factor 4A，eIF4A)进而抑制脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)翻译的起始促进抑郁症的发展。这些结果表明PDCD4是诱导抑郁症发生的新基因，可能成为抗抑郁药物研发的新靶点并为新型抗抑郁药物的设计和研究奠定理论基础。
本文的目的是在已有研究的基础上，以PDCD4为靶点、以PDCD4调控BDNF表达的分子机制为理论基础。利用小干扰RNA沉默PDCD4表达、利用干扰肽和小分子化合物干扰PDCD4与下游靶基因的相互作用。设计、筛选和制备相关药物并通过体外细胞模型和CRS诱导的小鼠抑郁模型，分析这些候选药物对PDCD4下游靶分子BDNF表达的影响以及在抑郁症治疗中的作用，为新型抗抑郁药物的研发奠定基础。
本项目的研究内容包括以下三个方面:
一、PDCD4特异性小干扰RNA制备、修饰及抗抑郁作用研究;
二、PDCD4干扰多肽的筛选、制备及抗抑郁作用研究;
三、PDCD4配体小分子的筛选及抗抑郁作用研究。
研究方法
一、PDCD4特异性小干扰RNA(siPdcd4)制备、修饰及抗抑郁作用研究
1.PDCD4小干扰RNA的制备及其对神经细胞BDNF表达影响
(1)筛选PDCD4的特异性小干扰RNA(siPdcd4)，转染细胞，采用RT-PCR和免疫印迹检测siPdcd4的沉默效率;
(2)脂质体法将siPdcd4转染至神经细胞，24h后免疫印迹检测其对PDCD4下游靶基因BDNF表达的影响。
2.探究PDCD4小干扰RNA对小胶质细胞炎性细胞因子表达的影响
(1)脂质体法将siPdcd4转染至小胶质细胞，24h后添加LPS和ATP刺激，收取不同时间梯度的细胞培养上清和总RNA;
(2)RT-PCR和ELISA检测siPdcd4对小胶质细胞炎性细胞因子(IL-6、IL-1β)表达的影响。
3.siPdcd4神经靶向修饰和干扰效率检测
(1)合成狂犬病毒糖蛋白靶向运输多肽(RVG-9dR);
(2)体外将Cy5荧光素标记的siPdcd4(Cy5-siPdcd4)进行神经靶向运输修饰(RVG/Cy5-siPdcd4);
(3)RVG/Cy5-siPdcd4处理神经细胞，高内涵成像检测红色荧光信号在细胞内的分布;
(4)RVG/Cy5-siPdcd4处理神经细胞48h后，RT-PCR和免疫印迹检测神经细胞中PDCD4表达变化。
4.神经细胞mTORC1失活时RVG/siPdcd4对BDNF表达的影响
(1)mTORC1特异性抑制剂rapamycin阻断神经细胞mTORC1信号通路，免疫印记检测不同时间梯度BDNF和PDCD4表达的变化;
(2)RVG/siPdcd4沉默神经细胞内源性PDCD4，24h后，添加rapamycin阻断mTORC1信号通路，免疫印迹检测RVG/siPdcd4对BDNF表达的影响。
5.检测RVG/siPdcd4能否跨过血脑屏障靶向入脑及对PDCD4和BDNF表达的影响
(1)将50μgRVG/Cy5-siPdcd4通过尾静脉注射至小鼠体内，6h、24h、48h、和72h分别通过小动物活体成像系统检测红色荧光在体内的分布;
(2)RT-PCR和免疫印迹检测海马区和前额叶皮质PDCD4的沉默效率和BDNF表达变化;
(3)RVG/siPdcd4浓度梯度实验，通过PDCD4的沉默效率和BDNF的表达变化确定体内实验最优RVG/siPdcd4使用浓度。
6.行为学评价RVG/siPdcd4对CRS诱导的抑郁样行为的影响
(1)慢性束缚应激诱导小鼠抑郁模型。将RVG/siPdcd4通过尾静脉注射至小鼠体内，RT-PCR检测海马区和前额叶皮质中PDCD4的沉默效率，免疫印迹和ELISA检测海马中BDNF表达的变化;
(2)ELISA检测海马和外周血中炎性细胞因子表达的变化，明确RVG/siPdcd4对抑郁症炎性水平的影响;
(3)脑组织进行高尔基染色，通过神经元树突棘密度评价神经突触可塑性的改变;
(4)通过悬尾实验、强迫游泳实验和蔗糖水偏好实验评价RVG/siPdcd4对小鼠抑郁样行为的影响。
二、PDCD4干扰多肽的筛选、制备及抗抑郁作用研究
1.筛选特异性干扰PDCD4与eIF4A结合的氨基酸序列
(1)构建eIF4A-HA、PDCD4-FLAG和BDNF-GFP过表达载体;
(2)查阅文献和蛋白结构数据库找到PDCD4与eIF4A相互作用的关键氨基酸位点及主要作用结构域(氨基酸序列);
(3)利用分子克隆构建关键结构域(氨基酸序列)与GFP的融合蛋白表达载体;
(4)通过免疫共沉淀和免疫印迹实验，筛选能够特异性干扰PDCD4与eIF4A结合并且上调BDNF的表达的结构域(氨基酸序列);
(5)将筛选的氨基酸序列与跨膜序列相偶联(N端)，合成相应的干扰多肽。
2.干扰多肽对PDCD4与eIF4A结合的影响
(1)免疫荧光实验检测干扰多肽的跨膜效率、细胞内稳定性以及与PDCD4蛋白的结合情况;
(2)免疫共沉淀及双荧光分子互补实验，检测干扰多肽对PDCD4和eIF4A结合的影响。
3.干扰多肽对BDNF表达的影响
(1)将PDCD4-FLAG和BDNF-GFP共同过表达于HEK-293细胞，免疫印迹检测干扰多肽对BDNF表达的影响;
(2)免疫印迹及ELISA实验检测干扰多肽对神经细胞BDNF表达的影响;
(3)ELISA检测神经细胞培养上清中分泌性BDNF和炎性细胞因子表达的变化。
4.神经细胞mTORC1失活时干扰多肽对BDNF表达的影响
在原代海马神经元mTORC1信号通路完全阻断的情况下，免疫印迹检测干扰多肽对神经元内源性BDNF表达的影响。
5.海马定点注射干扰多肽对CRS诱导的焦虑及抑郁样行为的影响
(1)野生型4-6周龄C57BL/6J雄性小鼠，慢性束缚应激诱导抑郁模型;
(2)根据小鼠冠状脑图谱，于海马脑区腹侧埋下微型给药管，免疫荧光检测干扰多肽在海马组织中的扩散情况;
(3)于抑郁小鼠海马区定点注射干扰多肽，治疗完成后免疫印迹实验和ELISA检测BDNF表达的变化;
(4)小鼠脑组织进行高尔基染色，统计分析海马神经元轴突树突棘密度，评价干扰多肽对神经突触可塑性的影响;
(5)干扰多肽治疗结束后进行行为学检测，评价干扰多肽对小鼠焦虑及抑郁样行为的影响。
三、PDCD4配体小分子的筛选及抗抑郁作用研究
1.PDCD4配体小分子的筛选
基于高斯过程的定量结构-活性关系回归预测(Gaussian process-based QSAR)在类药物生物源化合物文库中进行高通量虚拟筛选。根据与靶蛋白的主要结合位置，筛选在微摩尔水平上与PDCD4蛋白具有高或中等亲和力的小分子化合物。
2.PDCD4配体小分子功能检测
(1)免疫共沉淀实验检测PDCD4配体小分子对PDCD4与eIF4A结合的影响;
(2)免疫印迹实验检测PDCD4配体小分子对神经细胞BDNF表达的影响;
(3)将PDCD4-FALG和BDNF-GFP过表达载体共同转染至HEK-293细胞，免疫印迹检测PDCD4过表达时PDCD4配体小分子对BDNF表达的影响;
(4)免疫印迹检测神经细胞mTORC1失活时PDCD4配体小分子对BDNF的表达影响。
3.PDCD4配体小分子对CRS诱导的抑郁样行为的影响
(1)慢性束缚应激诱导小鼠抑郁模型，将不同浓度的PDCD4配体小分子通过腹腔注射至小鼠体内。免疫印迹实验和ELISA检测抑郁小鼠海马和前额叶皮质BDNF表达的变化;
(2)脑组织进行高尔基染色，通过神经元轴突树突棘密度评价神经突触可塑性的变化;
(3)对小鼠进行行为学检测评价PDCD4配体小分子对抑郁样行为的影响。
结果
一、PDCD4特异性小干扰RNA制备、修饰及抗抑郁作用研究
前期研究结果显示抑郁症患者海马区PDCD4表达升高，于海马区过表达PDCD4后野生型小鼠出现自发抑郁样行为。而PDCD4敲除小鼠则完全抵抗慢性束缚应激导致的抑郁行为的产生，提示PDCD4是治疗抑郁症的重要靶点。为此，本部分利用PDCD4小干扰RNA干扰中枢神经系统PDCD4的表达，研究其抑郁症的治疗效应。
(一)siPdcd4干扰效率检测及其对PDCD4下游靶基因表达的影响
(1)首先通过对PDCD4的mRNA核酸序列进行分析，从核酸数据库筛选、合成了PDCD4小干扰RNA(siPdcd4)，并通过细胞学实验证明能有效沉默PDCD4的表达。
(2)siPdcd4对BDNF表达的影响:通过脂质体法将siPdcd4转染至神经细胞，免疫印迹实验检测siPdcd4对下游靶基因BDNF表达的影响。结果显示siPdcd4沉默PDCD4后可明显上调神经细胞BDNF的表达。
(3)siPdcd4对炎性细胞因子表达的影响:PDCD4不仅可抑制BDNF，而且可负向调控促炎性细胞因子的表达。因此，我们进一步探究siPdcd4对小胶质细胞炎性细胞因子表达的影响，结果显示siPdcd4能够明显抑制LPS和ATP刺激诱导的IL-6和IL-1β的表达。
(二)siPdcd4神经细胞靶向修饰及特异性检测
(1)siPdcd4神经细胞靶向修饰:为了解决siPdcd4静脉注射不能通过血脑屏障入脑的技术瓶颈，我们合成了嗜神经的狂犬病毒糖蛋白多肽(RVG-9dR)。已经证明RVG-9dR多肽的9个D-精氨酸通过电荷相吸与siPdcd4结合，能够对siPdcd4进行神经靶向修饰(RVG/siPdcd4)。另外，为了便于体内示踪，采用Cy5荧光素(红色)对siPdcd4进行了标记(Cy5-siPdcd4)，制备了既具有神经特异性又可示踪的RVG/Cy5-siPdcd4复合物。
(2)RVG/siPdcd4神经细胞靶向的特异性检测:为了检测RVG-9dR修饰后的siPdcd4(RVG/siPdcd4)神经靶向特异性，我们用RVG/Cy5-siPdcd4分别去处理具有乙酰胆碱受体的神经细胞(SH-SY5Y、HT-22)和小胶质细胞(BV2)以及不表达乙酰胆碱受体的非神经细胞Hela。通过高内涵成像系统检测Cy5-siPdcd4在细胞的分布，结果显示，神经细胞SH-SY5Y、HT-22和BV2的细胞浆中均能够观察到带红色荧光的siPdcd4，而非神经细胞Hela的细胞浆中无明显红色荧光信号。
(3)沉默效率检测:RT-PCR和免疫印迹结果显示RVG/siPdcd4能够在转录和翻译水平沉默神经细胞SH-SY5Y、HT-22和BV2内源性PDCD4的表达，而对非神经细胞Hela的PDCD4无明显沉默作用。
以上结果表明，RVG-9dR多肽修饰的siPdcd4(RVG/siPdcd4)特异性进入神经细胞并且沉默PDCD4的表达。
(三)RVG/siPdcd4逆转神经细胞mTORC1失活对BDNF的抑制作用
我们前期机制研究发现，抑郁症时脑内PDCD4表达升高是由于mTORC1活性降低导致PDCD4磷酸化-泛素化降解途径受阻的结果。故我们用mTORC1特异性抑制剂rapamycin去抑制海马神经元细胞HT-22和小胶质细胞BV2的mTORC1活性，建立模拟抑郁小鼠脑内变化的细胞模型。我们发现与体内结果一致mTORC1被抑制后PDCD4出现累积，BDNF的表达受到明显抑制。在相同的实验体系下，我们发现RVG/siPdcd4能够逆转神经细胞mTORC1失活对BDNF的抑制作用。
(四)RVG/siPdcd4能够跨过血脑屏障靶向入脑
为了检测RVG-9dR能否携带siRNA跨过血脑屏障。我们将RVG/Cy5-siPdcd4通过尾静脉注射至小鼠体内，通过活体成像系统进行体内示踪。结果显示6h时RVG/Cy5-siPdcd4已经由外周输运至脑组织但是进入剂量较少，此时Cy5-siPdcd4主要存在于小鼠的腹部。而24h时RVG/Cy5-siPdcd4则主要聚集于脑内，腹部无明显荧光。48h时脑内红色荧光依然存在但是与24h相比明显减弱。72h时脑内无可检测到的红色荧光信号。上述结果提示RVG/Cy5-siPdcd4能够跨过血脑屏障靶向入脑并且具有良好的稳定性。与此同时，在RVG/siPdcd4注射48h后通过RT-PCR和免疫印迹实验检测了海马和前额叶皮质中BDNF的表达变化。结果显示RVG/siPdcd4注射至小鼠体内通过沉默海马和前额叶皮质中的PDCD4上调BDNF的表达。
(五)静脉注射RVG/siPdcd4可治疗慢性束缚应激诱导的抑郁症
为了探究RVG/siPdcd4对抑郁症的治疗效果，慢性束缚应激诱导小鼠抑郁模型。诱导成功后通过尾静脉注射RVG/siPdcd4进行抗抑郁治疗:
(1)RT-PCR和免疫印迹实验结果显示，RVG/siPdcd4能有效沉默抑郁小鼠海马和前额叶皮质中的PDCD4、降低促炎性细胞因子IL-6和IL-1β表达并显著提升BDNF的表达;
(2)脑组织高尔基染色实验结果显示，RVG/siPdcd4可增加海马神经元轴突树突棘的密度，改善神经突触可塑性;
(3)行为学检测结果表明，RVG/siPdcd4能够降低悬尾实验、强迫游泳实验小鼠的不动时间，增加抑郁小鼠的蔗糖水偏好指数。
以上结果表明，RVG/siPdcd4通过沉默PDCD4、抑制促炎细胞因子IL-6和IL-1β的表达、上调BDNF的表达和修复神经突触可塑性治疗CRS诱导的抑郁症。
二、PDCD4干扰多肽的筛选、制备及抗抑郁作用研究
前期机制的探索发现PDCD4通过结合eIF4A进而抑制BDNF的翻译促进抑郁症的发展。提示，如果干扰PDCD4和eIF4A的结合将解除PDCD4对BDNF的抑制作用进而治疗抑郁症。因此本部分根据PDCD4和eIF4A结合的位点筛选能够干扰二者相互作用的干扰多肽并对其抗抑郁作用进行研究。
(一)eIF4A结合PDCD4关键序列的筛选
通过分析已有的研究结果我们发现eIF4A的P56、K83、G137、T159和R360是eIF4A与PDCD4结合的关键氨基酸位点。根据氨基酸位点所在位置我们设计了4段可能结合PDCD4的序列，分别命名为eIF4A-Q、eIF4A-I、eIF4A-Ia和eIF4A-VI。为了验证各个氨基酸序列的功能，我们构建了eIF4A-Q、eIF4A-I、eIF4A-Ia和eIF4A-VI与GFP的融合蛋白表达载体，采用免疫共沉淀和免疫印迹实验确定这些基序对PDCD4与eIF4A结合的影响。结果显示，eIF4A-VI干扰PDCD4与eIF4A结合的能力最强，并且能明显上调BDNF的表达。而eIF4A-Q、eIF4A-I和eIF4A-Ia虽然能够干扰PDCD4与eIF4A的结合，但是对BDNF的表达有明显的抑制作用。因此，eIF4A-VI成为后续研究的候选序列。
(二)eIF4A-VI的跨膜修饰及其对PDCD4与eIF4A结合的影响
由于PDCD4与eIF4A的结合主要发生于细胞浆内。为了使筛选的序列进入细胞发挥作用，将具有跨膜效应的9个精氨酸(9 Arginine)偶联在eIF4A-VI的N端，合成了具有跨膜特性的9R-eIF4A-VI干扰多肽。另外，为了证明9R-eIF4A-VI干扰多肽的特异性，我们将363号氨基酸由R363突变为Q363合成了突变多肽Mu-9R-eIF4A-VI作为对照。免疫荧光结果表明，干扰多肽能在1h内跨过细胞膜进入细胞浆并在细胞内能够稳定存在48h，进一步研究发现9R-eIF4A-VI干扰多肽与PDCD4蛋白存在明显的共定位。与此同时，免疫共沉淀与双荧光分子互补实验结果表明9R-eIF4A-VI干扰多肽能够显著干扰PDCD4与eIF4A的结合，但相同的突变多肽Mu-9R-eIF4A-VI却无此效应。以上结果表明9R-eIF4A-VI干扰多肽通过靶向PDCD4特异性干扰PDCD4与eIF4A的结合。
(三)干扰多肽特异性上调BDNF的表达
将PDCD4-FLAG和BDNF-GFP过表达载体按照3∶1的质量比共转染于HEK-293细胞，6h后添加9R-eIF4A-VI干扰多肽，免疫印迹实验检测BDNF表达的变化。结果表明，9R-eIF4A-VI干扰多肽能够逆转PDCD4过表达对BDNF的抑制作用，但相同浓度的Mu-9R-eIF4A-VI多肽对BDNF表达的上调作用消失。为了明确干扰多肽对神经细胞内源性BDNF表达的影响。不同浓度的9R-eIF4A-VI干扰多肽处理神经细胞(原代海马神经元、小鼠海马神经元细胞HT-22和小胶质BV2)。免疫印迹结果表明9R-eIF4A-VI干扰多肽能够显著上调神经细胞内源性BDNF的表达。与此同时，通过炎性细胞因子的表达水平评价了9R-eIF4A-VI干扰多肽对神经细胞的副反应。ELISA结果显示，9R-eIF4A-VI干扰多肽并不会诱发炎性相关细胞因子IL-6和IL-10表达上调。
(四)干扰多肽逆转海马神经元mTORC1失活对BDNF的抑制作用
在前期的工作中，我们在海马神经细胞系和小胶质细胞中用mTORC1活性抑制剂成功构建了模拟抑郁小鼠脑内变化的细胞模型。为了探究9R-eIF4A-VI干扰多肽对神经元BDNF表达的影响，我们用rapamycin去抑制原代海马神经元mTORC1的活性。我们发现与前期结果一致，mTORC1失活后PDCD4出现累积，BDNF的表达受到明显抑制。而9R-eIF4A-VI干扰多肽能够逆转原代海马神经元mTORC1失活对BDNF的抑制作用。
(五)海马区注射干扰多肽能够缓解CRS诱导的焦虑和抑郁样行为
为了检测9R-eIF4A-VI干扰多肽对焦虑和抑郁样行为的影响。通过CRS诱导小鼠抑郁模型，模型构建成功后，通过脑立体定位将9R-eIF4A-VI干扰多肽定点注射至抑郁小鼠的海马区:
(1)脑组织免疫荧光结果显示干扰多肽能够通过定位注射扩散至整个海马组织;
(2)免疫印迹实验和ELISA结果显示干扰多肽能够显著上调抑郁小鼠海马中BDNF的表达;
(3)脑组织高尔基染色结果表明干扰多肽通过增加神经元突触棘密度，改善神经突触可塑性;
(4)行为学结果显示，干扰多肽治疗组小鼠在悬尾实验、强迫游泳实验中与CRS组相比不动时间明显减少。蔗糖水偏好实验中干扰多肽治疗组小鼠蔗糖水偏好指数明显高于CRS组。旷场实验和高架十字实验干扰多肽治疗组小鼠中央区的停留时间显著低于CRS组。
以上结果表明，海马区定点注射9R-eIF4A-VI干扰多肽通过上调BDNF表达、改善神经突触可塑性，缓解CRS诱导的焦虑和抑郁样行为。
三、PDCD4配体小分子的筛选及抗抑郁作用研究
尽管干扰多肽和siRNA药物有特异性高、免疫原性低等优势，但制备成本高、不能口服用药，将来临床应用会受到一定限制。为了克服这种不足，在本部分研究工作中，我们主要探索PDCD4配体小分子化合物治疗抑郁症的可行性
(一)PDCD4配体小分子的筛选
已有研究报道，通过高通量虚拟筛选从类药物小分子文库中筛选了6种可能与PDCD4结合的小分子化合物。进一步研究发现，一种小分子化合物与PDCD4具有高亲和力，另一种小分子与PDCD4具有中等亲和力。模拟结果显示这两种化合物主要通过氢键和π-π键与PDCD4C端MA-3结构域的氨基酸相连接，但是结合后的功能尚不清楚。故本课题选择这两种小分子为候选化合物(分别命名为ZHJ-204和ZHJ-690)检测其对PDCD4靶分子BDNF表达的影响。
(二)PDCD4配体小分子对BDNF表达的影响
(1)首先，我们检测了小分子ZHJ-204和ZHJ-690对神经细胞内源性BDNF表达的影响，结果显示10pM至1nM的ZHJ-204和ZHJ-690能显著上调HT-22和BV2BDNF的表达，并且具有浓度依赖性;
(2)神经细胞mTORC1失活体外抑郁模型结果表明，ZHJ-204和ZHJ-690能够解除rapamycin对BDNF的抑制作用，而且小分子ZHJ-204相较于ZHJ-690对BDNF的上调作用更为显著;
(3)在PDCD4过表达模型中，我们发现小分子ZHJ-204和ZHJ-690能够逆转PDCD4过表达对BDNF的抑制作用。
以上结果表明，PDCD4配体小分子ZHJ-204和ZHJ-690能够上调BDNF的表达。
(三)PDCD4配体小分子抗抑郁作用研究
通过CRS诱导小鼠抑郁模型，诱导完成后进行配体小分子的干预治疗。我们将不同浓度的配体小分子通过腹腔注射至小鼠体内，对照组注射等量的生理盐水，每天注射一次共10次，治疗完成后进行抑郁行为学评价和脑组织生化标志物分析。
(1)首先，我们检测了抑郁症相关脑区海马和前额叶皮质中BDNF表达的变化。免疫印迹结果显示，持续的CRS能够降低海马和前额叶皮质中BDNF的含量，而ZHJ-204(5mg/kg)的治疗能够显著上调抑郁小鼠海马和前额叶皮质中BDNF的表达。
(2)行为学结果表明，ZHJ-204(5mg/kg)治疗组小鼠在悬尾实验和强迫游泳实验中不动时间与CRS组相比显著降低。蔗糖水偏好实验结果显示ZHJ-204(5mg/kg)治疗组小鼠蔗糖水偏好指数明显高于CRS组。
以上结果表明，腹腔注射PDCD4配体小分子ZHJ-204通过上调BDNF的表达缓解CRS诱导的抑郁样行为。
结论
1.神经靶向修饰的PDCD4小干扰RNA(RVG/siPdcd4)通过特异性沉默PDCD4、抑制促炎性细胞因子表达、上调BDNF表达、改善神经突触可塑性治疗CRS诱导的抑郁症。
2.海马定位注射特异性干扰PDCD4与eIF4A结合的9R-eIF4A-VI干扰多肽，通过上调BDNF的表达缓解CRS诱导的焦虑和抑郁样行为。
3.腹腔注射PDCD4配体小分子ZHJ-204通过上调海马和前额叶皮质中BDNF的表达缓解CRS诱导的抑郁样行为。
创新性及意义
1.我们首次将小核酸药物用于抑郁症的治疗，并且通过体外修饰解决了siRNA神经靶向问题。并且发现经过脑内靶向修饰的siPdcd4(RVG/siPdcd4)通过静脉注射能够缓解CRS诱导的抑郁样行为，RVG/siPdcd4有可能成为新的抗抑郁药物。
2.在多肽类抗抑郁药物的研究中，我们筛选并设计了能特异性干扰PDCD4与eIF4A结合的9R-eIF4A-VI干扰多肽。体内实验证明海马定点注射9R-eIF4A-VI干扰多肽能够缓解CRS诱导的焦虑和抑郁样行为。进一步证明了PDCD4促进抑郁症的分子机制并为抗抑郁药物的研究提供了新的策略，同时为干扰多肽类的抗抑郁药物的研发奠定了基础。
3.在小分子类抗抑郁药的研究中，我们从类药物小分子文库中筛选了PDCD4的配体小分子，并且证明了腹腔注射PDCD4配体小分子ZHJ-204通过上调BDNF的表达缓解CRS诱导的抑郁样行为。我们的工作为研究新型小分子抗抑郁药物提供了前期工作基础。
局限性
1.RVG/siPdcd4药代动力学，药物安全评价等相关研究尚未完成。
2.尽管脑内注射9R-eIF4A-VI干扰多肽显现出明显的抗抑郁效应，但外周用药的修饰和效应尚需进一步研究。
3.虽然已经证明PDCD4配体小分子有一定抗抑郁作用，但仍需要对小分子化合物进行进一步的改造和修饰，以便提高其活性和成药性。