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S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionine, SAM)作为所有生物体内的重要中间代谢物,具有重要的生理作用和良好的临床应用价值。为了利用重组毕赤酵母高效合成SAM,本实验室在前期工作中构建了一株表达高活性SAM合成酶(MAT)的重组毕赤酵母DS16,通过外源添加L-甲硫氨酸(L-Met),由MAT催化L-Met与ATP在胞内合成SAM。但与野生菌GS115相比,DS16中MAT活性的增加程度远高于SAM浓度的增加程度,表明限制重组菌中SAM积累的因素已非MAT活性。基于以上工作,本论文通过对SAM合成及利用途径的分析,以寻找合适的MAT酶活水平和降低SAM在胞内的转化利用为目标,构建组成型GAP启动子文库,利用筛选得到的系列弱启动子精确地调控p-胱硫醚合成酶的表达,降低SAM经高半胱氨酸向胱硫醚的转化,进一步提高SAM在重组菌中的积累。为了快速而有效地筛选到强度改变的组成型突变启动子,我们建立了适用于毕赤酵母组成型表达文库筛选的高通量方法。首先,以酵母增强型绿色荧光蛋白(yEGFP)为报告基因,构建重组菌G/GHg验证了yEGFP在组成型启动子GAP (PGAp)调控下的正确表达,并通过培养基优化,排除了培养基对绿色荧光蛋白检测的干扰,确定了利于yEGFP表达和快速检测的筛选培养基。随后,考察了接种时间、接种量和培养时间对yEGFP表达和菌体生长的影响,建立了最佳培养条件,实现了48深孔板中各孔细胞生长的同步,胞内yEGFP荧光强度和细胞密度的标准差分别小于8%和7%。最后,利用高通量方法筛选了300株整合了(PGAP突变序列-yEGFP)表达单元的重组菌,从中挑选出6株yEGFP表达水平在G/GHg0.6%—218%范围内的重组细胞(G01、G02、G03、GO、G6),经过摇瓶培养,利用流式细胞仪验证了48孔板的筛选结果,并通过突变启动子序列及yEGFP转录水平的测定,证实了突变启动子对报告基因表达的调控,表明所建立的高通量筛选方法能高效、灵敏、可靠地筛选到强度微量改变的启动子突变体。利用建立的高通量方法筛选了30,000个重组细胞,从中挑选出调控范围在原PGAP强度0.6%—19.6倍之间呈梯度改变的33个突变启动子,组成功能性GAP启动子文库。对7个代表性突变启动子G1、G2、G3、G4、G5、G6和G7进行序列测定后,分别从三个报告基因(egfp、lacZ和ds16)的转录、蛋白和酶活水平证实了其对3个基因表达的连续精确调控能力。最后,利用这7个突变启动子,在重组毕赤酵母中分别对MAT活性进行稳定的精确连续调控,并通过摇瓶培养考察了不同重组菌中MAT表达活性对细胞生长和SAM合成的影响。结果表明,促进SAM合成而不影响细胞正常生长的临界MAT比酶活水平处于0.9～1.2 U/mg范围。以上代谢分析结果表明,在比酶活超过临界值的重组菌中,如DS16,继续提高酶活并不能增加SAM产量,为了促进胞内SAM积累,可对SAM转化和利用途径进行弱化。因此,我们利用启动子文库中的弱启动子,对胱硫醚合成途径中的关键酶β-胱硫醚合成酶(CBS)基因cys4表达进行下调,构建了CBS合成途径被逐渐弱化的重组菌GO-CBS、G6-CBS和G12-CBS。在摇瓶中考察,各重组菌的生长与出发菌DS16相比没有明显差异,但它们的胞内SAM浓度,与DS16相比发生了不同的变化：重组菌GO-CBS降低了9.2%,G6-CBS和G12-CBS分别提高了23.8%和31.2%。对重组菌中CBS酶活和cys4基因转录水平的分析表明,与出发菌DS16相比,GO-CBS中CBS酶活水平提高了15%,G6-CBS和G12-CBS则分别降低了14%和73%；cys4转录强度在GO-CBS中增加了25%,G6-CBS和G12-CBS中下降低28%和92%。结果表明,利用弱启动子G6和G12能有效下调CBS基因的表达,降低SAM在胞内向半胱氨酸转化的通量,从而提高SAM积累。在5L反应器中对重组菌G12-CBS进行考察,与原出发菌DS16相比,G12-CBS的胞内SAM浓度(146.8 mg/g DCW)和SAM体积产量(6.7g/L)分别提高了39.3%和48.8%；G12-CBS消耗的外源L-Met量与出发菌株相比减少了15%,其L-Met转化率达到34.6%,比DS16(19.4%)提高了78%。15 L反应器中,G12-CBS的生长、SAM产量和L-Met转化率显著优于DS16,分别提高了30%、1.2倍和1.5倍,单位体积SAM产量和L-Met的转化率分别达到11.9g/L和49.5%,与5L反应器的水平相比分别提高了78%和43%。反应器中的结果进一步验证了G12-CBS的优良性状,该重组菌无论是在提高产量还是降低发酵成本(减少L-Met的添加)上都更具优势,具备了产业化的潜力。此外,为了探索更大程度地减少SAM在胞内的转化利用,进一步提高重组细胞积累SAM的能力,我们尝试了敲除重组菌DS16的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因spe2、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶基因sah1和L-甲硫氨酰tRNA合酶基因msml,分别构建了相应的重组菌G/Dspe、G/Dsah和G/Dmsm。与出发菌DS16相比,重组菌G/Dspe、G/Dsah和G/Dmsm的生长没有受到影响,各重组菌单位菌体的SAM产量分别提高了29.3%、55.6%和24.8%。且SAM产量受到L-Met添加量的影响,将添加量从0.1%降到0.06%后,G/Dsah和G/Dmsm单位菌体的SAM产量分别提高了7.1%和9.5%。