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背景: 创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是临床常见的损伤类型,临床治疗终结后,患者往往遗留不同程度学习、记忆等认知功能障碍,给患者本人、家庭和社会都带来了沉重的心理和经济负担。学习记忆等认知功能的形成、保持与海马突触结构的完整性密切相关,而海马是脑外伤的易损区,临床观察发现各部位脑损伤都可引起海马CA1区、CA3区、齿状回等处的突触功能障碍。MicroRNAs是在转录后水平调控靶mRNA表达的关键因子,在神经细胞生长、分化过程中发挥重要作用,脑损伤后海马区出现microRNAs特异性表达变化,另外,研究发现miR-101与细胞自噬、凋亡、增殖及肿瘤细胞的浸润、迁移过程密切相关,对组织细胞缺氧状态十分敏感。在脑损伤发生发展过程中,脑组织缺血缺氧后的氧化应激反应是非常重要的环节,Nrf2-ARE信号通路是机体内源性抗氧化应激的重要途径之一,Cullin3-E3泛素化连接酶通过结合于Nrf2-Keap1复合体而降解Nrf2,调节细胞内Nrf2稳态。在血管内皮细胞中,miR-101结合于Cullin3 mRNA的3’-UTR而作用于Nrf2/HO-1通路,影响后续抗氧化应激反应。但是目前miR-101在脑损伤后海马组织病理生理学改变中的作用及其是否参与了脑损伤后认知功能的调控,机制尚不明确,因此,我们推测miR-101可能通过参与内源性抗氧化应激途径,调控海马神经元凋亡与再生,影响突触结构、功能,进而调控认知功能。 目的: 建立大鼠中度创伤性脑损伤模型,观察脑损伤后大鼠认知功能改变及海马CA1区神经元形态学变化,研究损伤后海马区miR-101及Cullin3的表达变化,同时检测内源性抗氧化应激Nrf2-ARE途径中Nrf2及HO-1的蛋白表达变化,探讨miR-101参与脑损伤后认知功能调控的可能机制。 方法: 清洁级SD大鼠,应用控制性皮层撞击损伤法建立中度脑损伤模型,分为对照组及脑损伤1d、3d、5d、7d组,采用事件相关电位P300测试各组大鼠的认知损害情况,H&E染色及TUNEL法观察细胞的结构形态及凋亡情况,microarray分析及qRT-PCR检测各组样本海马组织中miR-101及Nrf2 mRNA表达变化,并利用Western blot技术检测海马中Nrf2、Cullin3、HO-1、βactin及凋亡相关蛋白SNCA的表达情况。 结果: 1、光镜下,可观察到伤后1d、3d、5d大鼠海马CA1区神经元出现变性、坏死及凋亡,至伤后7d细胞结构、形态趋于正常。H&E染色切片见,伤后1d、3d、5d组神经元明显肿胀,形态不规则,排列紊乱,伤后7d时细胞形态及排列有所恢复。TUNEL染色发现,伤后1d、3d凋亡细胞增多,细胞胞体缩小,伤后5d正常细胞数目逐渐增加,7d时已接近正常水平。 2、Microarray基因芯片检测损伤后1d、3d、5d组miR-101的表达情况,与对照组相比,miR-101表达特异性上调(P<0.01)。qRT-PCR检测损伤组miR-101表达较对照组明显上调,3d时达高峰(P<0.01),至伤后7d逐渐恢复。 3、Western-blot检测显示,大鼠海马区Cullin3、Nrf2、HO-1、SNCA蛋白的表达水平在TBI后1d、3d逐步升高(P<0.01),伤后7d时基本恢复至正常水平。 4、P300检测显示,伤后大鼠的学习记忆功能明显损害,伤后1d至3d,P300潜伏期随损伤时间延长而延长,并在伤后3d时达到高峰(415.2ms±4.97ms,P<0.01),后逐渐恢复,至伤后7d逐渐已接近正常对照组水平(332.8ms±12.24ms,P>0.05)。损伤组波幅较对照组降低,但无统计学意义。 5、miRNA-101的Microarray检测结果与P300潜伏期显著相关(r=0.817,P<0.01),qRT-PCR与P300潜伏期间存在较弱相关关系(r=0.491,P>0.05),但不具有统计学意义。Nrf2 mRNA表达水平与P300潜伏期明显相关(r=0.728,P<0.01),Nrf2蛋白表达水平与P300潜伏期呈明显相关关系(r=0.675,P<0.01),Cul3、HO-1蛋白与P300潜伏期间均显著相关(P<0.01)。MiR-101基因芯片检测结果分别与Nrf2 mRNA及Nrf2、Cul3蛋白表达水平明显相关(P<0.01),Nrf2蛋白分别与Cul3、HO-1蛋白表达水平显著相关(P<0.05)。 结论: 1、中度创伤性脑损伤可引起大鼠海马神经元发生变性、凋亡、坏死,可能是伤后P300检测潜伏期延长的病理形态学基础。 2、miR-101与脑损伤后认知损害存在一定关联性,其机制可能为:通过结合于Cullin3 mRNA而间接参与细胞内Nrf2-ARE抗氧化应激途径,上调内源性抗氧化应激酶蛋白HO-1水平,减轻脑外伤后继发性脑损伤的发展过程,继而保护神经元突触连接的完整性,改善大鼠脑损伤认知功能损害。