副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus,Vp）是一种人兽共患的致病菌,不仅会导致海洋动物的弧菌病,还能引起人类患败血症、肠胃炎和伤口感染。嗜中性粒细胞的吞噬作用是机体天然免疫中对抗感染和损伤的一个重要防御机制。由于斑马鱼在受精后的前三周只存在先天免疫,使它具有哺乳动物等其他实验模型不具备的优势,目前斑马鱼已广泛的应用于宿主和病原体相互作用的研究中,尤其在天然免疫应答研究中具有突出优势。为了探究副溶血弧菌和斑马鱼嗜中性粒细胞之间的动态变化,以及Notch分子参与天然免疫应答的作用,本实验首先通过三亲本杂交的方法将带有红色荧光蛋白（red fluorescent protein,RFP）的质粒转化至Vp57中,获得了荧光标记的细菌,命名为Vp57^RFP。检测了RFP标记的质粒在Vp57中的稳定性和Vp57在标记前后生长曲线及毒力的差异,为后续示踪Vp57^RFP感染嗜中性粒细胞实验提供了宝贵的材料。之后,观察了Vp57^RFP在斑马鱼体内与嗜中性粒细胞之间的动态变化,建立了人工感染3dpf（days post fertilization）斑马鱼幼鱼的实验模型。接下来,通过Q-PCR检测了Vp57^RFP在浸泡和注射感染3dpf的wt和notch1a^-/-斑马鱼后,嗜中性粒细胞相关的细胞因子和补体系统中相关基因的表达情况,为研究Notch分子参与斑马鱼先天免疫的作用机制提供借鉴。为了进一步研究细胞因子等免疫相关基因在先天免疫中的作用,最后我们采用生物信息学软件分析了细胞因子tnfb、il11b和il13基因5’上游2000bp左右的序列,并预测了其相关的转录因子,克隆启动子,构建双荧光素酶报告基因表达载体,经双酶切和测序鉴定,最后通过双荧光素酶报告基因系统检测重组载体的活性。实验结果如下:（1）通过三亲本杂交成功将Vp57菌株标了记红色荧光蛋白质粒,并且标记后质粒稳定,在M9无机培养基中传代320代后质粒稳定率维持在18.2%。Vp57^RFP和Vp57的生长曲线相似,0.3h之内为对数增长期,2h后进入稳定期。毒力也未发生明显改变,Vp57的LD₅₀为2.002x10⁷CFU/ml,Vp57^RFP的LD₅₀为2.178x10⁷CFU/ml。这些都为之后用Vp57^RFP进行示踪实验奠定了基础。（2）斑马鱼的嗜中性粒细胞为圆形或类圆形,细胞核形态多样,多为两叶的分叶核。通过尾静脉注射579CFU的Vp57^RFP感染3dpf的斑马鱼,观察到Vp57^RFP随时间的推移,先后出现在尾部的注射部位、心脏、耳泡、眼睛等,嗜中性粒细胞也由最初的注射部位迁移至各个感染的器官中,3h后,幼鱼死亡,身体的各个部位基本全被细菌覆盖,脊柱轻微弯曲,并且在体节中有少量Vp57^RFP出现。当注射剂量增加至974CFU,幼鱼的死亡时间提前至约2.5h,鱼体弯曲更加严重。（3）用Vp57^RFP浸泡和尾静脉注射分别感染3dpf的wt和notch1a^-/-斑马鱼,Q-PCR检测嗜中性粒细胞相关的细胞因子和补体系统的相关基因的表达情况,结果显示,尾静脉注射的感染方式下,细胞因子如:il1b、ifnphil、ccl-c5a、cxcl8a和补体基因c3、c6、c9、bf、bf3都比浸泡感染表达量高,说明尾静脉注射的感染方式引起的斑马鱼急性免疫反应更为强烈。而且尾静脉注射感染的wt组的细胞因子表达量都比notch1a^-/-低,而wt组的补体基因中只有c6和c9的表达量比notch1a^-/-组低,而其他补体基因的表达都比notch1a^-/-组高。说明notch1a确实对先天免疫中嗜中性粒细胞有负向调控作用,且不同的补体基因的应答模式不同。（4）tnfb的转录因子结合位点为:Oct-1、TBP、GATA-1、RSRFC4、GLO、C/EBPalpha、NF-kappaB、ER、Pit-1a、Oct-2、Oct-2.1、RAP1。il11b的转录因子结合位点包括:Oct-1、SRF、GR、RAR-alpha1、COUP、NF-kappaB、MEB-1、NF-1、AP-1。il13的转录因子结合位点包括:AP-1、GATA-1、NF-1、C/EBPalpha、TBP、Oct-1。tnfb、il11b和il13的启动子区没有发现CpG岛,其5’侧翼序列含有与转录密切相关的TATA Box和CAAT Box转录元件并且将三种基因的启动子片段插入pGL3-enhancer构建pGL3-tnfb-promoter-enhancer、pGL3-il11b-promoter-enhancer、p GL3-il13-promoter-enhancer三种质粒后,质粒经酶切测序显示酶切片段大小一致,序列正确;双荧光素酶报告基因检测系统证实构建的报告基因载体具有启动子活性。根据生物信息学分析结果,成功构建tnfb、il11b和il13基因启动子双荧光素酶报告基因表达载体,为研究细胞因子参与的免疫相关的信号通路之间的调控提供了有力的研究工具。总之,本研究为探究Vp的荧光标记手段提供了新的思路,构建的Vp-斑马鱼嗜中性粒细胞人工感染的疾病模型为未来在临床上监测嗜中性粒细胞对Vp的清除效果提供了借鉴,最后也为研究Notch分子参与斑马鱼天然免疫应答的细胞机制及调控作用提供了一定的参考依据。