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研究背景：消化道肿瘤是最常见的恶性肿瘤之一。食管癌、大肠癌、胃癌等的发病率和死亡率一直位居各种癌症的前列。当前对消化道肿瘤的治疗主要采用手术、放疗以及化疗,但是放、化疗的毒副作用明显,且效果并不令人满意。因此,寻找新的药物治疗靶点显得尤为重要。RbAp48 (Retinoblastoma-associated protein 48)属WD-40蛋白家族,最初被鉴定为Rb蛋白的结合蛋白,其分子量为48kDa。RbAp48参与多种复合物的作用,比如ATP-依赖重组复合物,组蛋白脱乙酰酶复合物Sin3,染色体组装因子与DNA序列配对复合物CAF-1,核染色质重构和脱乙酰酶NuRD。近期研究发现RbAp48是PcG (Polycomb group protein, PcG)的主要成员之一,PcG能特异性催化组蛋白H3第27位赖氨酸甲基化,从而实现靶基因的沉默。研究发现RbAp48在肺癌、宫颈癌、甲状腺癌、急性髓细胞白血病、原发性肝癌等恶性肿瘤中均呈现异常高表达,这表明RbAp48与肿瘤的发生、发展有密切关系。本课题组前期研究发现下调RbAp48基因表达能抑制肺癌细胞生长并逆转其顺铂耐药性。由此本研究设想：下调RbAp48表达也可能对消化道肿瘤的生长繁殖存在抑制作用；RbAp48可能是治疗消化道肿瘤的一个潜在靶点,为此我们进行了相关的研究。第一部分下调RbAp48表达对人食管癌细胞增殖作用的研究目的：研究下调RbAp48表达对人食管癌细胞增殖的作用,探索RbAp48作为食管癌治疗靶点的可能性。方法：1、免疫组化检测RbAp48在食管癌组织及其癌旁组织中的表达。2、Western blot法检测siRNA干扰RbAp48表达效果。3、RbAp48-siRNA转染细胞后：①MTT法检测人食管癌细胞EC109、人正常上皮细胞L132生长情况。②平板克隆形成实验检测EC109细胞克隆形成能力变化。③MTT检测EC109、EC109/DDP细胞对顺铂敏感性变化。4、体内实验：BABL/C裸鼠皮下接种EC109成瘤后,瘤内注射RbAp48-siRNA,比较肿瘤生长差异。5、①β-半乳糖酐酶染色法检测细胞衰老情况。②流式细胞术检测细胞周期变化及细胞凋亡。结果:1、RbAp48在食管癌组织中表达明显高于其癌旁组织中的表达。2、RbAp48-siRNA能有效下调EC109细胞株中RbAp48的表达。3、RbAp48-siRNA转染细胞后：①阴性对照组与RbAp48-siRNA组EC109细胞的抑制率分别为：(18.54±2.80)%、(45.24±2.74)%(p<0.01),RbAp48-siRNA组抑制率明显升高,而正常上皮细胞株L132细胞生长抑制率无显著变化(p>0.05)；②空白组、阴性对照组、RbAp48-siRNA组克隆形成数分别为165.00±13.00、161.00±11.53和101.00±3.61,RbAp48-siRNA组克隆形成数明显减少(p<0.01)。③顺铂对EC109空白组、阴性对照组和RbAp48-siRNA组细胞的IC50值分别为4.76 ±0.09μmol/L、2.87±0.14μmol/L、0.89±0.02μmol/L(p<0.01),顺铂对食管癌耐药株细胞EC109/DDP空白组、阴性对照组和RbAp48-siRNA组细胞的IC50值分别为25.69±0.69μmol/L,15.58±0.36μmol/L、8.26±0.96μmol/L(p<0.01),两种细胞对顺铂敏感性均显著增加。4、体内实验：与空白组相比,肿瘤重量由997.10±141.50 mg下降为202.50±81.34 mg(p<0.01),肿瘤体积由1627.00±261.90mm3下降为371.40±155.90 mm3(p<0.01)。5、①与空白组、阴性对照组相比,RbAp48-siRNA组细胞出现明显的衰老现象。②与空白组、阴性对照组相比,RbAp48-siRNA组细胞发生明显G2/M期阻滞：转染后第三天G2/M期细胞比例分别由(13.35±2.84)%、(16.97±2.64)%上升为(31.48±11.39)%(p<0.01)。③与空白组、阴性对照组相比,RbAp48-siRNA组转染后第四天细胞凋亡率由(5.44±1.36)%、(7.25±0.44)%上升为(12.18±0.50)%(p<0.01)。结论：1、RbAp48在食管癌组织中表达明显高于其癌旁组织。2、下调RbAp48表达能阻滞食管癌细胞周期,诱导细胞衰老、凋亡,抑制细胞增殖,对正常细胞没有明显作用。3、下调RbAp48表达,能显著提高食管癌细胞及其耐药细胞株对顺铂的敏感性。4、RbAp48有望成为治疗食管癌的新靶点。第二部分下调RbAp48表达对人大肠癌细胞增殖作用的研究目的：研究下调RbAp48表达对人大肠癌细胞增殖的作用,探索RbAp48作为大肠癌治疗靶点的可能性。方法：1、免疫组化检测RbAp48在大肠癌组织及其癌旁组织中的表达。2、Western blot法检测siRNA干扰RbAp48表达效果。3、RbAp48-siRNA转染细胞后：①MTT法检测人大肠癌细胞HT-29、人正常上皮细胞L132生长情况。②平板克隆形成实验检测HT-29细胞克隆形成能力变化。③MTT法检测HT-29细胞对5-FU敏感性变化。4、体内实验：BABL/C裸鼠皮下接种HT-29成瘤后,瘤内注射RbAp48-siRNA,比较肿瘤生长差异。5、①β-半乳糖酐酶染色法检测细胞衰老情况。②流式细胞术检测细胞周期的变化及细胞凋亡。结果：1、RbAp48在大肠癌组织中表达明显高于其癌旁组织。2、RbAp48-siRNA能有效下调HT-29中RbAp48的表达。3、RbAp48-siRNA转染细胞后：①阴性对照组与RbAp48-siRNA组抑制率分别为：(5.08±1.24)%、(33.69±6.30)%(p<0.01),RbAp48-siRNA组抑制率明显升高,而正常上皮细胞株L132细胞生长抑制率无显著变化(p>0.05)。②空白组、阴性对照组、RbAp48-siRNA组克隆形成数分别为组108.70±4.67、103.00±2.08和68.00±4.62,RbAp48-siRNA组克隆形成数明显减少(p<0.01)。③5-FU对HT-29空白组、阴性对照组和RbAp48-siRNA组细胞的IC50值分别为94.89±6.97μmol/L、 57.42±2.74μmol/L和17.80±0.42μmol/L(p<0.01),细胞对5-FU敏感性均显著增加。4、体内实验：与空白组相比,肿瘤重量由210.2±93.04 mg下降为90.44±59.87 mg(p<0.05),肿瘤体积由377.20±193.40 mm3下降为141.80±79.35mms(p<0.05)。5、①与空白组、阴性对照组相比,RbAp48-siRNA组细胞出现明显的衰老现象。②RbAp48-siRNA转染HT-29细胞后未发生明显细胞周期阻滞也未发生明显细胞凋亡。结论：1、RbAp48在大肠癌组织中表达明显高于其癌旁组织。2、下调RbAp48表达能诱导细胞衰老,抑制细胞增殖,对正常细胞没有明显作用。3、下调RbAp48表达能显著提高大肠癌细胞对5-FU的敏感性。4、RbAp48有望成为治疗大肠癌的新靶点。第三部分下调RbAp48表达对人胃癌细胞增殖作用的研究目的：研究下调RbAp48表达对人胃癌细胞增殖的作用,探索RbAp48作为胃癌治疗靶点的可能性。方法：1、免疫组化检测RbAp48在胃癌组织及其癌旁组织中的表达。2、Western blot法检测siRNA干扰RbAp48表达效果。3、RbAp48-siRNA转染细胞后：①MTT法检测人胃癌细胞HGC-27、人正常上皮细胞L132细胞生长情况。②平板克隆形成实验检测克隆形成能力。③MTT检测HGC-27细胞对5-FU敏感性变化。4、①p-半乳糖酐酶染色法检测细胞衰老情况。②流式细胞术检测细胞周期的变化及细胞凋亡。结果：1、RbAp48在胃癌组织中表达明显高于在胃癌旁组织中的表达。2、RbAp48-siRNA能有效下调HGC-27中RbAp48的表达。3、RbAp48-siRNA转染细胞后：①阴性对照组与RbAp48-siRNA组抑制率分别为：(35.00±2.04)%、(70.39±1.21)%(p<0.01),RbAp48-siRNA组抑制率明显升高,而正常上皮细胞株L132细胞生长抑制率无显著变化(p>0.05)。②空白组、阴性对照组、RbAp48-siRNA组克隆形成数分别为组111.30±8.62、31.33±2.19和4.00±1.73,RbAp48-siRNA组克隆形成数明显减少(p<0.01)。③5-FU对HGC-27空白组、阴性对照组和RbAp48-siRNA组细胞的IC50值分别为3.42±0.39μmol/L.1.84 ± 0.04μmol/L和0.07±0.02μmol/L(p<0.01),下调RbAp48表达后细胞对5-FU敏感性均显著增加。4、①与空白组、阴性对照组相比,RbAp48-siRNA组细胞出现明显的衰老现象。②与空白组、阴性对照组相比,RbAp48-siRNA组细胞发生明显G2/M期阻滞：转染后第五天G2/M期细胞比例分别由(8.42±0.28)%、(13.33±2.94)%上升为(30.75±1.65)%(p<0.01)。③与空白组、阴性对照组相比,RbAp48-siRNA组转染第五天细胞凋亡率由(14.94±5.90)%、(16.02±2.12)%上升为(61.30±8.07)%(p<0.01)。结论：1、RbAp48在胃癌组织中表达明显高于其癌旁组织。2、下调RbAp48表达能阻滞胃癌细胞周期,诱导细胞衰老、凋亡,抑制细胞增殖,对正常细胞没有明显作用。3、下调RbAp48表达,能显著提高胃癌细胞对5-FU的敏感性。4、RbAp48有望成为治疗胃癌的新靶点。