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第一部分长链非编码RNA LINC00961对TGF-β诱导的人心脏微血管内皮细胞的损伤和内皮间质转分化的调节及其机制目的:1.研究长链非编码RNA LINC00961对TGF-β诱导的人心脏微血管内皮细胞的损伤和内皮间质转分化的影响2低表达LINC00961抑制人心脏微血管内皮细胞内皮间质转分化的机制方法:1.验证TGF-β诱导人心脏微血管内皮细胞内皮间质转分化及细胞损伤。人心脏微血管内皮细胞购自Scien Cell研究实验室,实验分为2组:对照组和TGF-β组,TGF-β组加入10ng/ml的TGF-β,作用时间48小时;分别用以上两组细胞进行以下实验:(1)光学显微镜观察两组细胞的形态变化;(2)CCK8检测两组心脏微血管内皮细胞的细胞活力;(3)流式细胞术检测心脏微血管内皮细胞的细胞凋亡率;(4)q RT-PCR测定两组心脏微血管内皮细胞的CD31、α-SMA、VE-Cadherin、FSP-1 m RNA相对表达水平;(5)Western blot测定两组心脏微血管内皮细胞的CD31、FSP-1、α-SMA、VE-Cadherin蛋白水平。2.过表达LINC00961促进TGF-β诱导的人心脏微血管内皮细胞的细胞损伤和内皮间质转分化,而低表达LINC00961则相反。人心脏微血管内皮细胞分别转染慢病毒使其LINC00961低表达和高表达,q RT-PCR检测其转染效率;细胞随机分为以下6组:对照组、TGF-β组(加入10ng/ml的TGF-β,作用时间48小时)、TGF-β+sh-LINC00961组(慢病毒转染使LINC00961低表达,加入10ng/ml的TGF-β,作用时间48小时)、TGF-β+sh-Scramble组(慢病毒空转,加入10ng/ml的TGF-β,作用时间48小时)、TGF-β+LV-LINC00961组(慢病毒载体使LINC00961高表达,加入10ng/ml的TGF-β,作用时间48小时)、TGF-β+LV-Control组(慢病毒空载,加入10ng/ml的TGF-β,作用时间48小时);分别用以上6组细胞进行以下实验:(1)CCK8试剂盒检测各组内皮细胞的细胞活性;(2)流式细胞术测各组内皮细胞的凋亡率;(3)免疫荧光染色法检测CD31+/α-SMA+双阳性细胞;(4)q RT-PCR检测各组内皮细胞的Bcl-2、Bax、Cyclin D1、CD31、α-SMA、VE-Cadherin、FSP-1 m RNA相对水平;(5)Western-blot检测各组内皮细胞的Bax、Bcl-2、Cyclin D1、Cleaved caspase3、CD31、α-SMA、VE-Cadherin、FSP-1蛋白水平。3.低表达LINC00961通过激活PTEN-PI3K-AKT信号通路抑制人心脏微血管内皮损伤和内皮间质转分化。实验分为以下4组:TGF-β+sh-LINC00961组(慢病毒载体使LINC00961低表达,加入10ng/ml的TGF-β,作用时间48小时)、TGF-β组(加入10ng/ml的TGF-β,作用时间48小时)、TGF-β+LV-LINC00961组(慢病毒载体使LINC00961高表达,加入10ng/ml的TGF-β,作用时间48小时)、TGF-β+sh-LINC00961+VO-Ohpic trihydrate组(慢病毒载体使LINC00961低表达,加入10ng/ml的TGF-β和35 nmol/L的VO-Ohpic trihydrate溶液,作用时间48小时);分别对以上4组细胞进行以下实验:(1)流式细胞术测各组内皮细胞的凋亡率;(2)免疫荧光染色法检测CD31+/α-SMA+双阳性细胞;(3)q RT-PCR检测各组的PTEN、PI3K、AKT、m TOR m RNA相对表达水平;(4)Western-blot检测各组的PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-m TOR、m TOR蛋白水平。结果:1.过表达LINC00961加重了TGF-β诱导的人心脏微血管内皮细胞的细胞损伤,低表达LINC00961则相反。CCK8检测结果示:与对照组相比,TGF-β组的细胞活性下降;与TGF-β组相比,TGF-β+LV-LINC00961组和TGF-β+sh-LINC00961组的细胞活力分别下降和增加。流式细胞检测结果示:与对照组相比,TGF-β组的内皮细胞凋亡率增加;与TGF-β组相比,TGF-β+LV-LINC00961组和TGF-β+sh-LINC00961组的细胞凋亡率分别增加和下降。q RT-PCR和Western blot结果示:与对照组相比,TGF-β组的Cyclin D1和Bcl2表达下降,Bax和Cleaved-caspase3表达增加;与TGF-β组相比,TGF-β+LV-LINC00961组的Cyclin D1和Bcl2表达减少,Bax和Cleaved-caspase3表达增加;与TGF-β组相比,TGF-β+sh-LINC00961组的Cyclin D1和Bcl2表达增加,Bax和Cleaved-caspase3表达减少。2.过表达LINC00961促进了TGF-β诱导的人心脏微血管内皮细胞内皮间质转分化,低表达LINC00961则相反。免疫荧光染色法检测结果显示:与对照组相比,TGF-β组的CD31表达减少和α-SMA表达增加;与TGF-β组相比,TGF-β+LV-LINC00961组和TGF-β+sh-LINC00961组的CD31表达分别减少和增加,而α-SMA表达分别增加和减少。q RT-PCR和Western blot结果显示:与对照组相比,TGF-β组的CD31和VE-Cad表达下降,α-SMA和FSP-1表达增加;与TGF-β组相比,TGF-β+LV-LINC00961组的CD31和VE-Cad表达减少,α-SMA和FSP-1表达增加;与TGF-β组相比,TGF-β+LV-sh LINC00961组的CD31和VE-Cad表达增加,α-SMA和FSP-1表达减少。3.低表达LINC00961通过激活PTEN-PI3K-AKT信号通路抑制人心脏微血管内皮损伤和内皮间质转分化。免疫荧光染色法检测结果显示:与TGF-β组相比,TGF-β+sh-LINC00961组的CD31表达增加,α-SMA表达减少,而TGF-β+LV-LINC00961组的CD31表达减少,α-SMA表达增加;与TGF-β+sh-LINC00961组相比,TGF-β+sh-LINC00961+VO-Ohpic trihydrate组的CD31表达下降,而α-SMA表达增加。流式细胞术检测结果显示:与TGF-β组相比,TGF-β+sh-LINC00961组的细胞凋亡率下降,而TGF-β+LV-LINC00961组的细胞凋亡率增加;与TGF-β+sh-LINC00961组相比,TGF-β+sh-LINC00961+VO-Ohpic trihydrate组的细胞凋亡率增加。q RT-PCR结果显示:与TGF-β组相比,TGF-β+sh-LINC00961组的PTEN基因表达增加,PI3K、AKT、m TOR基因表达减少,而TGF-β+LV-LINC00961组的PTEN基因表达减少,α-SMAPI3K、AKT、m TOR基因表达增加;与TGF-β+sh-LINC00961组相比,TGF-β+sh-LINC00961+VO-Ohpic trihydrate组的PTEN基因表达下降,而PI3K、AKT、m TOR基因表达增加。Western blot结果显示:与TGF-β组相比,TGF-β+sh-LINC00961组的PTEN蛋白表达增加,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-m TOR/m TOR蛋白表达比值减少,而TGF-β+LV-LINC00961组的PTEN蛋白表达减少,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-m TOR/m TOR蛋白表达比值增加;与TGF-β+sh-LINC00961组相比,TGF-β+sh-LINC00961+VO-Ohpic trihydrate组的PTEN蛋白表达下降,而p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-m TOR/m TOR蛋白表达比值增加。结论:1.TGF-β能导致人心脏微血管内皮细胞出现内皮间质转分化和细胞损伤;2.过表达LINC00961促进TGF-β诱导的人心脏微血管内皮细胞的细胞损伤和内皮间质转分化,低表达LINC00961则相反,其机制是通过调控PTEN-PI3K-AKT信号通路。第二部分长链非编码RNA LINC00961对心肌梗死后心功能下降及心肌纤维化的调节及其机制目的:探讨长链非编码RNA LINC00961对心肌梗死后心功能下降、内皮间质转分化及心肌纤维化的调节及其机制方法:取野生型和LINC00961-/-(利用CRISPR/Cas介导的基因组工程敲除LINC00961基因)6周龄C57BL/6小鼠(重约20-24g)各20只,对小鼠的左前降支冠状动脉进行永久性结扎,构建心肌梗死模型,假手术组小鼠除不结扎左前降支外,其他操作都一样。将野生型和LINC00961-/-小鼠随机分成以下6组:野生型+假手术组、LINC00961-/-+假手术组、野生型+心肌梗死组、LINC00961-/-+心肌梗死组、野生型+心肌梗死+Oroxin B组(腹腔注射Oroxin B溶液)、LINC00961-/+心肌梗死+Oroxin B组(腹腔注射Oroxin B溶液)。14天后进行以下如下实验:(1)用心脏彩超评估各组小鼠的心脏功能,评估指标包括:左室短轴缩短率、左室射血分数、左室收缩末径、左室舒张末径、M型心动图;(2)苏木精-伊红染色评估各组小鼠心肌的结构变化和马松染色评估各组小鼠心肌纤维化程度及胶原容积分数;(3)免疫荧光染色法检测CD31+/α-SMA+双阳性细胞;(4)免疫组化检测各组小鼠心脏的Collagen I和Collagen III表达量;(5)q RT-PCR检测各组小鼠心肌PTEN、PI3K、AKT、m TOR、Collagen I、Collagen III基因表达;(6)Western blot检测PTEN、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-m TOR、m TOR、Collagen I、Collagen III蛋白表达。结果:1.敲除LINC00961基因减轻了心肌梗死后心功能下降、内皮间质转分化及心肌纤维化。心脏彩超结果显示:与野生型+假手术组相比,LINC00961-/-+假手术组的左室射血分数、左室短轴缩短率、左室舒张末径、左室收缩末径无明显差异;与野生型+心肌梗死组相比,LINC00961-/-+心肌梗死组的左室射血分数、左室短轴缩短率增加,而左室舒张末径、左室收缩末径下降。免疫荧光染色法检测结果显示:与野生型+假手术组相比,LINC00961-/-+假手术组的CD31+/α-SMA+双阳性细胞表达无明显差异;与野生型+心肌梗死组相比,LINC00961-/-+心肌梗死组的CD31+表达增加而α-SMA+表达下降;苏木精-伊红和马松染色结果显示:与野生型+假手术组相比,LINC00961-/-+假手术组的心肌纤维排列紊乱程度及胶原容积分数无明显差异;与野生型+心肌梗死组相比,LINC00961-/-+心肌梗死组的心肌纤维排列紊乱程度及胶原容积分数下降。免疫组化结果显示:与野生型+假手术组相比,LINC00961-/-+假手术组的Collagen I、Collagen III表达无明显差异;与野生型+心肌梗死组相比,LINC00961-/-+心肌梗死组的Collagen I、Collagen III表达降低。2.Oroxin B减轻了心肌梗死后心功能下降、内皮间质转分化及心肌纤维化。心脏彩超结果显示:与野生型+心肌梗死组相比,野生型+心肌梗死+Oroxin B组的左室射血分数、左室短轴缩短率增加,左室舒张末径、左室收缩末径下降;与LINC00961-/-+心肌梗死组相比,LINC00961-/-+心肌梗死+Oroxin B组的左室射血分数、左室短轴缩短率增加,左室舒张末径、左室收缩末径下降。免疫荧光染色法检测结果显示:与野生型+心肌梗死组相比,野生型+心肌梗死+Oroxin B组的CD31+表达增加而α-SMA+表达下降;与LINC00961-/-+心肌梗死组相比,LINC00961-/-+心肌梗死+Oroxin B组的CD31+表达增加而α-SMA+表达下降;苏木精-伊红和马松染色结果显示:与野生型+心肌梗死组相比,野生型+心肌梗死+Oroxin B组的心肌纤维排列紊乱程度及胶原容积分数下降;与LINC00961-/-+心肌梗死组相比,LINC00961-/-+心肌梗死+Oroxin B组的心肌纤维排列紊乱程度及胶原容积分数下降。免疫组化结果显示:与野生型+心肌梗死组相比,野生型+心肌梗死+Oroxin B组的Collagen I、Collagen III表达降低;与LINC00961-/-+心肌梗死组相比,LINC00961-/-+心肌梗死+Oroxin B组的Collagen I、Collagen III表达降低。3.敲除LINC00961基因可以激活PTEN-PI3K-AKT信号通路减轻心肌梗死后心功能下降及心肌纤维化。qRT-PCR结果显示:与LINC00961-/-+假手术组相比,LINC00961-/-+心肌梗死组的PTEN基因表达减少,而PI3K、AKT、m TOR、Collagen I、Collagen III基因表达增加,与LINC00961-/-+心肌梗死组相比,LINC00961-/-+心肌梗死+Oroxin B组的PTEN基因表达增加,而PI3K、AKT、m TOR、Collagen I、Collagen III基因表达下降。Western blot结果显示:与LINC00961-/-+假手术组相比,LINC00961-/-+心肌梗死组的PTEN蛋白下降,而p-m TOR/m TOR、p-AKT/AKT、p-PI3K/PI3K蛋白表达比值和Collagen III、Collagen I蛋白增加;与LINC00961-/-+心肌梗死组相比,LINC00961-/-+心肌梗死+Oroxin B组的PTEN蛋白表达增加,而p-PI3K/PI3K、p-m TOR/m TOR、p-AKT/AKT蛋白比值和Collagen III、Collagen I蛋白均增加。结论:1.心肌梗死后14天,小鼠心脏会出现心功能下降、内皮间质转分化、心肌纤维化;2.敲除小鼠LINC00961基因可以减轻心肌梗死后心功能下降和心肌纤维化,其可能的机制是通过激活PTEN信号通路,下调PI3K、AKT、m TOR。