背景与目的:脑出血有着高发病率及高死亡率,占所有卒中患者的10-15%。在我国,脑出血致死的患者占脑血管病致死患者的61.7%,目前已成为国人的首要致死疾病。尽管近年来在脑出血病理生理研究中已经取得了巨大的进步,但是针对脑出血有效的治疗手段尚十分有限。越来越多的证据表明炎症反应在脑出血继发脑损伤中发挥了重要作用。ICH后,激活的小胶质细胞释放的炎症因子能够加重脑组织炎症损伤,同时趋化外周炎症细胞向中枢浸润,从而进一步加重了中枢神经系统炎症反应。使用芬戈莫德抑制炎症细胞向中枢浸润可以显著改善脑出血所致的炎症损伤。然而另有研究发现芬戈莫德在某些情况下反而能加重神经炎症。提示广谱的抑制炎症细胞浸润同时,也抑制了具有保护作用的调节性T淋巴细胞(Treg)浸润。因此特异的抑制致炎细胞浸润或增加Treg细胞浸润可能为脑出血提供新的治疗方法。Foxp3+的Treg细胞可以抑制多种炎症细胞的增殖及激活。Treg细胞功能受损可以导致一系列自身免疫功能紊乱。在缺血性卒中后,使用CD25抗体删除Treg细胞可以加重神经炎症,而输注Treg细胞具有保护作用。但是Treg细胞介导的中枢神经系统保护的机制目前尚不清楚。虽然输注Treg细胞能减轻中枢炎症,但是其技术要求较高,且费时费力,因此很难应用于临床。既往研究提示,Treg细胞发挥免疫抑制作用主要通过两条途径。第一条主要由其表面分子如CTLA-4或LAG-3作用于抗原递程细胞或其他淋巴细胞,通过细胞与细胞的直接作用从而抑制相应细胞的激活。另一条途径则是通过Treg细胞释放的细胞因子如IL-10或TGF-β作用于其他细胞后发挥免疫抑制作用。与此同时,小胶质细胞作为中枢本身的巨噬细胞也参与了脑出血所致的病理生理过程。越来越多的证据提示中枢小胶质细胞可以根据其表面标志及细胞内细胞因子不同分为M1和M2两种类型。M1型被认为能够产生大量前炎症因子,加重炎症反应,损害脑组织;而M2型小胶质细胞能够分泌保护性的细胞因子,并且通过其吞噬功能的增强而加快坏死组织清除及损伤修复。在缺血性卒中后M2型的小胶质细胞可以向M1极化从而加重炎症损伤,逆转该病理过程可能减轻炎症反应改善神经功能,但是,小胶质/巨噬细胞极化在ich后的动态变化及机制目前仍不明了。近来研究提示,在创伤性脑损伤中gsk3β/pten/pi3k/akt信号途径介导了小胶质细胞极化,同时,treg细胞也可以调节小胶质/巨噬细胞从m1型向m2型极化。因此,我们推测treg细胞分泌的抑炎因子可以通过gsk3β/pten信号诱导血红蛋白激活的小胶质/巨噬细胞向m2极化从而减轻了脑出血所致的炎症损伤。本研究将使用foxp3dtr小鼠,cd25抗体和cd28-sa进一步探讨treg细胞在脑出血中的作用,并且阐明treg细胞发挥保护作用的具体机制,进而为脑出血提供新的治疗靶点。方法:第一部分treg细胞可以减轻脑出血炎症损伤1.构建自体血脑出血模型,分别于1天,4天,7天和14天处死小鼠,取出血半球制备脑单细胞悬液。使用cd45,cd3,cd4,cd11b和foxp3的荧光偶联抗体标记炎症细胞后,用流式细胞技术分析脑出血后脑组织中小胶质细胞、所有淋巴细胞、th细胞及treg细胞的变化趋势,结合western-blots分别分析th细胞中或血肿周围组织中的foxp3的表达。2.foxp3dtr小鼠腹腔注射dtx删除treg细胞48小时后,制备自体血脑出血模型。分别评估其出血后1天,3天,5天和7天的神经功能缺损评分。在脑出血第4天处死部分小鼠取脑,比较小鼠脑含水量及血肿体积变化,同时使用fjb染色检测小鼠的神经元坏死;使用rt-pcr检测血肿周围组织炎症因子(il-1β,il-6,tnf-α,il-10和tgf-β)变化。3.向wt小鼠腹腔注射cd25抗体删除treg细胞48小时后,制备自体血脑出血模型。分别评估其出血后1天,3天,5天和7天的神经功能缺损评分。在脑出血第4天处死部分小鼠,取脑比较小鼠脑含水量及血肿体积变化,同时使用fjb染色检测小鼠的神经元坏死,使用rt-pcr检测血肿周围组织炎症因子(il-1β,il-6,tnf-α,il-10和tgf-β)变化。4.制备自体血脑出血模型3小时后腹腔注射cd28超激动剂(cd28-sa)扩增treg细胞。分别评估脑出血后1天,3天,5天和7天的神经功能缺损变化。在脑出血后第4天处死部分小鼠,取脑比较小鼠脑含水量及血肿体积变化,同时使用fjb染色检测小鼠的神经元坏死,使用rt-pcr检测血肿周围组织炎症因子(il-1β,il-6,tnf-α,il-10和tgf-β)变化。第二部分treg细胞诱导脑出血激活后的小胶质/巨噬细胞向m2极化。1.分别用5μm,10μm,20μm和40μm的血红蛋白(hb)刺激原代培养的小胶质细胞6小时,然后用rt-pcr测定其tnf-α的表达。同时,搜集小胶质细胞用annexin-vfitc和碘化丙啶进行标记,然后使用流式细胞技术检测小胶质细胞凋亡的变化。2.向foxp3dtr小鼠腹腔注射dtx删除treg细胞2天后制备自体血脑出血模型,另一组小鼠在造模后3小时向腹腔注射cd28超激动抗体扩增treg细胞。在脑出血4天后,分别处死小鼠取脑制备单细胞悬液,然后使用cd45-apc,cd11b-percpcy5.5,mhc-ii-fitc和cd206-pe染色,并使用流式细胞技术检测小胶质/巨噬细胞数量变化及其表面mhc-ii和cd206分子的平均荧光强度变化。3.利用10μm的hb刺激小胶质细胞原代培养模型6小时后构建transwell模型:将从wt小鼠脾脏新鲜分选出的treg细胞与hb刺激后的小胶质细胞共培养40小时。搜集小胶质细胞,利用流式细胞技术检测小胶质细胞表面mhc-ii和cd206的平均荧光强度变化,利用rt-pcr技术检测小胶质细胞tnf-α和il-6的表达变化。第三部分treg细胞通过il-10/gsk3β/pten信号途径调节小胶质/巨噬细胞向m2极化1.利用10μm的hb刺激原代培养的小胶质细胞6小时后建立transwells模型:将新鲜分选出的treg细胞与hb激活后的小胶质细胞共培养,并在相应的孔里加入il-10抗体或tgf-β抗体。40小时后,消化搜集小胶质细胞,利用流式细胞技术检测小胶质细胞表面mhc-ii和cd206的平均荧光强度变化,利用rt-pcr技术检测小胶质细胞tnf-α和il-6的表达变化。2.利用10μm的hb刺激原代培养的小胶质细胞6小时后建立transwells模型:将新鲜分选出的treg细胞与hb激活后的小胶质细胞共培养,并在相应的孔里加入il-10抗体或tgf-β抗体。40小时后,消化搜集小胶质细胞,利用western-blots检测小胶质细胞gsk3β,p-gsk3β,pten和p-pten的表达变化。3.使用gsk3β-shrna,pten-shrna,non-target-shrnaorgfpcontainingparticles转染原代培养的小胶质细胞48小时后,利用免疫荧光检测评价转染成功率。利用10μm的hb刺激原代培养的小胶质细胞6小时后建立transwells模型:将新鲜分选出的treg细胞与hb激活的小胶质细胞共培养,并在相应的孔里加入il-10抗体或tgf-β抗体。40小时后搜集小胶质细胞,利用western-blot检测p-gsk3β和p-pten的表达变化。结果:第一部分treg细胞可以减轻脑出血炎症损伤1.脑出血后小胶质细胞数量变化不明显,总t淋巴细胞在脑出血1天后明显增高,4天达峰,随后逐渐下降,脑出血后第14天仍高于假手术组小鼠。th细胞与总t淋巴细胞有相似的变化趋化。treg细胞在脑出血后第4天开始增加并且保持该增加幅度至14天。脑组织及脾脏中的th细胞上foxp3的表达均明显上调。2.与注射dtx的wt小鼠相比,foxp3dtr小鼠脑出血后神经功能缺损明显加重。treg细胞删除后小鼠脑出血后的脑含水量,血肿体积明显增加,同时神经元坏死增加,m1来源的炎症因子(il-1β,il-6,和tnf-α)表达增加,其中以il-1β和tnf-α表达变化最为显著,而m2来源的炎症因子(il-10和tgf-β)表达无明显差异。3.与注射igg的对照小鼠相比,注射cd25删除treg细胞后小鼠的神经功能缺损明显加重。treg细胞删除后小鼠脑出血后的脑含水量,血肿体积明显增加,同时神经元坏死增加,m1来源的炎症因子(il-1β,il-6,和tnf-α)表达增加,其中以il-6表达变化最为显著,而m2来源的炎症因子(il-10和tgf-β)表达无明显差异。4.与注射igg的对照小鼠相比,注射cd28超激动抗体扩增treg细胞后小鼠的神经功能缺损明显减轻。treg细胞扩增后小鼠脑出血后的脑含水量,血肿体积明显减少,同时神经元坏死减少,m1来源的炎症因子(il-1β,il-6,和tnf-α)表达减少,而m2来源的炎症因子(il-10和tgf-β)表达增加(以il-10最为显著)。第二部分treg细胞诱导脑出血激活后的小胶质/巨噬细胞向m2极化1.rt-pcr结果提示tnf-α的表达在5μm血红蛋白刺激后开始上升,20μm刺激浓度是达到最高,在40μm刺激浓度时反而下降。流式细胞技术检测凋亡结果提示随着血红蛋白刺激浓度的增加,小胶质细胞凋亡明显增多。2.与假手术组相比,脑出血4天后血肿周围组织中小胶质/巨噬细胞数量变化不显著,然而其表面mhc-ii和cd206分子均有上调。与ich小鼠相比,treg细胞删除可以引起血肿周围组织小胶质/巨噬细胞浸润增加,同时伴随有mhc-ii表达上升,cd206表达下降。相反,treg细胞扩增后虽然不引起小胶质/巨噬细胞数量变化及其mhc-ii的表达变化,但是可以增加cd206的表达。3.体外脑出血模型提示,与对照相比,在hb刺激后,小胶质细胞表面cd206和mhc-ii表达明显上升,同时伴随有细胞内tnf-α和il-6的表达上调。使用treg细胞与小胶质细胞共培养后可以明显减少hb激活的小胶质细胞上mhc-ii,tnf-α和il-6的表达,同时增加其cd206的表达。第三部分Treg细胞通过IL-10/GSK3β/PTEN信号途径调节小胶质/巨噬细胞向M2极化。1.与对照组相比,在Hb激活的小胶质与Treg细胞共培养模型中加入IL-10抗体能够使得小胶质细胞的MHC-II分子表达上升,CD206分子表达下降,TNF-α和IL-6表达增加。而TGF-β作用于小胶质细胞后不会引起上述变化。2.与对照相比,Hb刺激可以导致小胶质细胞GSK3β,P-PTEN和P-GSK3β表达下降,PTEN表达变化不显著。Treg细胞与Hb激活的小胶质细胞共培养后能增加小胶质细胞上GSK3β,P-GSK3β和P-PTEN的表达。在Treg细胞和Hb激活的小胶质细胞共培养模型中,加入IL-10抗体后可以减少小胶质细胞上GSK3β,P-GSK3β和P-PTEN的表达,而TGF-β抗体对小胶质细胞没有上述作用。3.使用针对GSK3β和PTEN的慢病毒转染小胶质细胞后,能成功抑制小胶质细胞上P-GSK3β和P-PTEN的表达。使用针对GSK3β的慢病毒转染小胶质细胞后,再与Treg细胞共培养,小胶质细胞上P-PTEN的表达明显下降,而使用针对PTEN的慢病毒抑制小胶质细胞上PTEN表达后再与Treg细胞培养,不会影响P-GSK3β的表达。该结果提示GSK3β在上游调控了PTEN的磷酸化。结论:1.删除Treg细胞可以加重脑出血后的炎症损伤而扩增Treg细胞能减轻该损伤。2.删除Treg细胞能够诱导血肿周围组织中的小胶质/巨噬细胞向M1型极化,而扩增Treg细胞能够诱导血肿周围组织中的小胶质/巨噬细胞向M2型极化。3.在血红蛋白刺激后,Treg细胞通过IL-10/GSK3β/PTEN信号诱导小胶质细胞向M2极化。上述研究提示Treg细胞能通过IL-10/GSK3β/PTEN信号途径诱导小胶质/巨噬细胞向M2极化,从而减轻了脑出血所致的炎症损伤,进而为脑出血提供了新的治疗靶点。