烟粉虱[Bemisiatabaci(Gennadius)]是一种危害多种农作物、园艺作物的世界性重大害虫。化学防治是控制烟粉虱的主要手段,但由于不合理的应用,烟粉虱已对使用的大多数杀虫剂产生了抗性。毗虫啉是目前广泛用于烟粉虱防治的一种新烟碱类药剂,新疆烟粉虱已对。毗虫咻产生了不同程度的抗性,但其抗性机制尚不明确。早期抗性检测可为烟粉虱的有效治理提供科学指导,而抗性机制的阐明是害虫抗性治理的重要前提。已有的研究表明细胞色素P450酶系某些家族基因的过表达是烟粉虱对新烟碱类杀虫剂产生抗性的重要机制之一。本研究以新疆烟粉虱作为研究对象,在明确不同地区种群对峨虫啉抗性水平的基础上,利用半定量和实时定量PCR技术筛选并确定新疆烟粉虱与。比虫啉抗性相关的P450差异表达基因,并对差异表达的基因进行功能验证。本研究结果可为烟粉虱抗性分子检测技术的开发奠定坚实的基础,也为其抗性治理策略的制定提供科学依据。本文主要研究结果概括如下:1、新疆烟粉虱对吡虫啉和噻虫嗪的抗性监测为了明确新疆烟粉虱对常用新烟碱类杀虫剂的抗性水平,为当地因地制宜防治方法的制定提供理论依据,本文采用成虫浸叶法测定了新疆吐鲁番(良种场、万亩蔬菜基地)、和田、莎车、伊宁烟粉虱对吡虫啉和噻虫嗪的抗性水平。结果显示,与烟粉虱敏感品系相比,和田、吐鲁番万亩蔬菜基地和莎车种群对吡虫啉已分别产生了低到中等水平的抗性(抗性倍数分别为6.74、8.49和18.18倍),而所有测试种群对噻虫嗪均表现敏感。2、烟粉虱定量PCR内参基因的筛选为了保证烟粉虱不同抗性种群目标基因分析的准确性,筛选表达稳定的内参基因是重要的前提。本文选取烟粉虱β-actin、HSP20、HSP90、γ-tubulin和RPL29作为候选内参基因,利用实时定量PCR(qPCR)测定这些基因在不同烟粉虱吡虫啉抗性种群中的表达量,采用geNorm和Normfinder软件分析这5个基因的表达稳定性。geNorm分析结果发现HSP20和HSP90的表达最为稳定:Normfinder分析结果显示HSP20和RPL29的表达最稳定。综合以上结果选择HSP20为烟粉虱不同抗性种群qPCR的最适内参基因,结果为烟粉虱抗性种群目标基因的准确定量提供了技术支撑。3、新疆烟粉虱对吡虫啉抗性相关的细胞色素P450过表达基因的确定为了明确新疆烟粉虱对吡虫啉的抗性机制,本文采用半定量和定量PCR筛选并确定抗性相关的P450靶基因。半定量PCR结果显示,CYP6CM1、CYP6CX4、CYP4G68、CYP415A1、CYP6DV4、CYP402C2、CYP6DV6、CYP6DW3、CYP416A1在吡虫啉抗性种群中的表达量明显高于敏感品系;实时荧光定量PCR结果进一步发现,相对于敏感种群,CYP6CM1在莎车种群中过量表达23.4倍,CYP4G68在和田及吐鲁番万亩蔬菜基地种群中分别过量表达3.4和3.8倍。上述结果初步表明CYP6CM1和CYP4G68的过表达可能是新疆烟粉虱对吡虫啉产生抗性的机制之一。4、新疆烟粉虱CYP6CM1和CYP4G68基因的体外表达及功能验证为了进一步明确新疆烟粉虱CYP6CM1和CYP4G68的功能,本文利用昆虫杆状病毒表达系统,对这两个基因进行了体外表达和功能验证。首先,我们成功构建了含有这两个CYP基因的pFastBacHTA重组供体质粒,并利用Sf9(草地贪夜蛾细胞)作为宿主进行表达;酶活力测定显示含目标基因的重组蛋白的酶活力明显高于对照;利用液相质谱分析CYP6CM1和CYP4G68的表达产物对吡虫啉的代谢活性,结果发现2个重组蛋白均能代谢吡虫啉,代谢产物初步确定为脱硝基烯烃毗虫啉。本文结果表明CYP6CM1和CYP4G6基因的过表达可能是新疆烟粉虱对吡虫啉产生抗性的主要分子机制之一。