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目的： 1、通过分子自组装技术构建高效靶向基因复合物EGF-PAMAM-MDR1-siRNA; 2、考察EGF-PAMAM-MDR1-siRNA基因复合物在MES-SA/DX5中的入胞情况; 3、考察MDR1基因的体外沉默效应（mRNA和蛋白水平）; 4、联合临床经典化疗药物紫杉醇，考察基因物质联合化疗药物对MES-SA/DX5细胞增殖、凋亡和迁移的影响。 方法： 1、基因复合物的制备:根据实验室前期研究结果，基因复合物PAMAM表面胺基与siRNA表面磷酸基团的最佳比例(N/P)为20∶1，siRNA∶EGF修饰物质量比=2∶1。将EGF、PAMAM、siRNA分别与相应体积的Opti-MEM混匀，分别制成对应的A、B、C液。制成PAMAM-MDR1-siRNA二元基因复合物，则将B液缓慢加入C液中，轻轻混匀，室温静置20 min。制成EGF-PAMAM-MDR1-siRNA三元基因复合物，则将A液缓慢加入B液与C液的混合物中，室温静置20 min。 2、基因复合物的细胞转染及其对细胞生长状态的影响:MES-SA/DX5细胞铺板至相应培养板，置于37℃、5％ CO2培养箱中孵育过夜。弃旧培养基，1×PBS与Opti-MEM培养基各清洗一次细胞，将据1所述方法制备的基因复合物加入细胞培养板，6h后换完全培养基，置于37℃、5％ CO2培养箱中继续培养18h或42 h。于转染后0h、6h、24 h、48 h后，将细胞置于倒置显微镜下观察细胞生长状态。 3、激光共聚焦显微镜(Confocal)考察基因复合物的入胞:所用siRNA经Cy5标记。经基因复合物转染的细胞在培养箱中孵育18 h后，弃旧培养基，加入Honechest33342染液1 mL/孔，孵育10 min后于Zeiss LSM710倒置激光扫描共聚焦显微镜下观察Cy5-siRNA进入MES-SA/DX5细胞情况。 4、RT-PCR、Western Blot、流式细胞术和Confocal考察基因复合物对MES-SA/DX5细胞中MDR1基因的沉默效应:所用siRNA为MDR1-siRNA。经基因复合物转染的细胞在培养箱中孵育42 h后收集所有的细胞，或提取所有细胞的RNA或蛋白。所提取的RNA逆转录为cDNA继而进行聚合酶链式反应，经核酸电泳后分析MDR1基因mRNA表达情况。所提取的蛋白经BCA蛋白定量试剂盒测定浓度后进行电泳、转膜、封闭、抗体孵育及显色后分析P-gp蛋白表达情况。所收集的细胞直接加入FITC标记的鼠抗人P-gp IgG，4℃暗处孵育30 min后立即用流式细胞仪检测P-gp蛋白的平均荧光强度。经基因复合物转染的细胞在培养箱中孵育42h后弃旧培养基，加阿霉素溶液(ADM)500μL/孔(10μg/mL)继续孵育4h后弃ADM加Honechest33342染液500μL/孔孵育10min，经Zeiss LSM710倒置金属激光扫描共聚焦显微镜观察MES-SA/DX5细胞对ADM的摄取情况，侧面验证MDR1基因的沉默效应。 5、Western Blot检测基因复合物与Taxol联用对MES-SA/DX5细胞凋亡相关蛋白（Bcl-2，Caspase-3）表达的影响:经基因复合物转染6h后的MES-SA/DX5细胞，联合应用Taxol溶液孵育48 h后提取所有细胞的蛋白。所提取的蛋白经BCA蛋白定量试剂盒测定浓度后进行电泳、转膜、封闭、抗体孵育及显色后分析Bcl-2，Caspase-3蛋白表达情况。 6、 CCK-8检测不同浓度基因复合物与Taxol联用对MES-SA/DX5细胞增殖毒性的影响:所用siRNA浓度分别为2，5，10μg/mL，所用Taxol浓度分别为5，10μg/mL。经不同浓度基因复合物转染6h后的MES-SA/DX5细胞，联合应用Taxol溶液孵育24 h、48 h后，加入CCK-810μL/孔继续孵育4h后经酶标仪检测MES-SA/DX5细胞吸光度值，根据公式分析MES-SA/DX5细胞增殖毒性情况。 7、流式细胞术检测基因复合物与Taxol联用对MES-SA/DX5细胞周期、细胞凋亡的影响:经基因复合物转染6h后的MES-SA/DX5细胞，联合应用Taxol溶液孵育24 h、48 h后收集所有细胞，经洗涤、染色后用流式细胞仪检测细胞周期分布情况和细胞凋亡情况。 8、细胞划痕实验检测基因复合物与Taxol联用对MES-SA/DX5细胞迁移能力的影响:先制备细胞划痕模型，经基因复合物转染6h后的细胞划痕模型，联合应用Taxol溶液后孵育24 h。于转染后采用Olympus(IX73)倒置显微镜拍照，分别采集转染后0h，6h，12h，18h，24h这5个时间段细胞图像，经OlympuscellSens Dimension软件分析MES-SA/DX5细胞迁移变化情况。 结果： 1、经分子自组装技术构建的EGF-PAMAM-MDR1-siRNA复合物基本不影响MES-SA/DX5细胞生长状态，能显著提高siRNA分子的细胞摄取率; 2、通过EGF-PAMAM递送的siRNA，能有效沉默MES-SA/DX5细胞MDR1基因mRNA和蛋白水平的表达; 3、EGF-PAMAM-MDR1-siRNA复合物联合经典化疗药物Taxol作用后，可显著抑制MES-SA/DX5细胞的增殖、迁移，使MES-SA/DX5细胞更多阻滞于S期，显著提高细胞凋亡比例。 结论： 综上所述，PAMAM作为一种新型的非病毒载体材料，能够有效将siRNA分子递送至子宫肉瘤细胞，进而沉默MES-SA/DX5细胞中MDR1基因mRNA和蛋白水平的表达，经EGF修饰后，沉默效应更为显著，联用化疗药物Taxol后，细胞凋亡比例可显著提高。MDR1基因在子宫肉瘤的多药耐药中起着至关重要的作用，有望成为治疗耐药性子宫肉瘤的有效靶点，而通过EGF-PAMAM递送靶向MDR1基因的siRNA可能是逆转子宫肉瘤多药耐药的有效途径。