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犏牛是普通牛和牦牛种间杂交所得后代,在产肉、产奶方面具有明显的杂种优势。然而犏牛雄性不育使其杂种优势无法横交固定,是牦牛新品种改良的“拦路虎”。已有的组织学和分子生物学研究发现,公犏牛精子发生过程受阻,犏牛睾丸中生精过程基因表达紊乱。哺乳动物Y染色体雄性特异区(MSY)基因在精子发生过程中具有至关重要的作用。牛MSY区域由单拷贝基因构成的X-退化区和多拷贝基因构成的过渡区和扩增区三部分组成。DNA甲基化能够调控基因表达,在哺乳动物生精过程中,DNA甲基化的异常将造成生精过程基因的表达紊乱,进而导致雄性不育。目前尚不清楚Y染色体基因表达模式及全基因组DNA甲基化差异与犏牛雄性不育的关系。因此,本试验选取成年普通牛(n=8)、牦牛(n=8)和犏牛(n=8)的睾丸组织,采用qPCR、RT-qPCR、Western Blot、全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)等技术,对MSY基因的拷贝数变异(CNV)、mRNA和蛋白表达以及全基因组DNA甲基化进行分析,获得如下结果:1.睾丸组织切片显示,犏牛睾丸组织生精小管中精原细胞和精母细胞显著减少,不存在圆形精子细胞和长形精子细胞,并且存在很多空泡。而普通牛和牦牛睾丸组织生精小管中细胞类型正常。通过对ZFY-10、UTY-19、mtDNA D-loop进行Sanger测序和序列分析,确认本试验样本的父系来源和母系来源。2.利用RT-qPCR对MSY的10个X-退化区基因在成年普通牛、牦牛、犏牛睾丸组织中的mRNA表达量进行比较分析。结果显示,RBMY、UBE1Y、EIF1AY在睾丸组织中特异表达,而其余基因在多种组织中广泛表达。UTY、OFD1Y、USP9Y在犏牛睾丸组织中的表达量显著高于普通牛和牦牛(P<0.004),而DDX3Y、EIF1AY、RBMY、ZFY、EIF2S3Y、ZRSR2Y、UBE1Y在犏牛睾丸组织中的表达量与普通牛和牦牛相比差异不显著(P>0.05)。该结果提示,UTY、OFD1Y和USP9Y在犏牛睾丸组织中的高表达可能与犏牛雄性不育相关。3.利用qPCR对MSY多拷贝基因TSPY1、PRAMEY、TSPY3、ZNF280BY、HSFY的拷贝数变异(CNV)进行比较分析。根据蛋白编码区序列的差异可将TSPY1、TSPY3和PRAMEY区分为2、2、4种亚型。利用类型特异且Y染色体特异性引物以DNA为模板进行qPCR分析显示:牦牛Y染色体上TSPY1-T2亚型DNA序列平均仅含1个拷贝,而普通牛平均含126个拷贝;牦牛Y染色体上缺少TSPY3-T2序列;PRAMEY-T2和PRAMEY-T4的拷贝数在牦牛Y染色体中发生了扩增。牦牛中ZNF280BY的拷贝数显著高于普通牛(P<0.001)。以上结果提示,普通牛和牦牛Y染色体基因结构存在差异。4.利用RT-qPCR对MSY多拷贝基因TSPY1、PRAMEY、TSPY3、ZNF280BY、HSFY的mRNA表达模式进行比较分析。结果显示,HSFY在睾丸和肌肉中主要表达,TSPY1、TSPY3、PRAMEY和ZNF280BY在睾丸中特异性或主要表达。与普通牛和牦牛相比,TSPY1-T2、PRAMEY-T2、HSFY和ZNF280BY在犏牛睾丸组织中的表达量极低,其表达模式与精子细胞标记基因PRM1和PRM2一致。PRAMEY-T3牦牛睾丸组织中的表达量与普通牛和犏牛相比显著降低(P<0.05),而在普通牛和犏牛间差异不显著(P>0.05);PRAMEY-T4在犏牛、牦牛、普通牛间无显著差异(P>0.05)。但通过自行制备PRAMEY-T3和PRAMEY-T4的特异性抗体进行western bolt分析发现,PRAMEY-T3在犏牛中表达升高,PRAMEY-T4在犏牛、牦牛、普通牛间无显著差异。结合犏牛睾丸组织中缺乏精子细胞的表型和mRNA表达模式,提示Y染色体多拷贝基因TSPY1-T2、ZNF280BY、HSFY和PRAMEY-T2可能主要参与减数分裂后的精子形成过程,这些基因的极低表达应该是由于犏牛无法正常产生精子而产生的结果。5.课题组已有转录组测序(RNA-Seq)分析发现精子发生相关基因在犏牛、普通牛和牦牛的睾丸组织间存在极显著差异表达。为了进一步探索犏牛雄性不育相关基因表达紊乱的表观遗传调控机制,利用WGBS对普通牛和F1代犏牛成熟睾丸组织DNA甲基化差异进行分析。结果显示,在差异甲基化区域(DMR),犏牛全基因组DNA甲基化程度显著升高,CpG岛、启动子区域和重复序列区域在犏牛睾丸中表现出超甲基化状态。鉴定出419个基因启动子发生超甲基化,主要富集于参与配子生成的DNA甲基化、piRNA代谢过程、精子生成等GO通路。联合RNA-seq数据发现,启动子发生超甲基化的piRNA生成通路基因在犏牛睾丸中mRNA表达极显著低于普通牛和牦牛(P<0.001)。由于粗线期piRNA对粗线期精母细胞向精子细胞转变过程起重要作用,piRNA生成受阻可能与犏牛无法正常产生精子相关。这些结果提示,生精关键基因在犏牛睾丸中发生超甲基化,将影响精子发生相关基因的表达和piRNA的生成,进而参与犏牛雄性不育。总之,本研究对普通牛、牦牛和犏牛Y染色体雄性特异区基因的表达模式分析表明,Y染色体的X-退化区基因和多拷贝基因在犏牛雄性不育中发挥不同的作用;对普通牛和犏牛睾丸组织的全基因组DNA甲基化差异分析表明,犏牛睾丸中基因组DNA发生明显超甲基化,启动子超甲基化主要涉及精子发生及piRNA生成通路基因,并抑制基因的表达。本研究结果揭示了Y染色体基因及基因组DNA甲基化与犏牛雄性不育的关系,将为揭示犏牛雄性不育的分子机制提供理论依据和科学数据。