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精液冷冻保存在长期保存、远距离运输、品种改良、生物安全等方面具有巨大潜能,是辅助生殖技术和种质资源储存的重要工具,在牛等物种上已逐渐成熟,得到广泛应用。但在猪上,采用复苏精液输精的比例很低,其主要原因是猪精子相比于其他物种的精子对于温度变化更为敏感,更易受到损伤。现阶段一些提高冷冻效率的方法在不同物种间效果有所差异,因此,应充分考虑其物种特异性,在借鉴其他物种研究的基础上,深度分析该物种所特有的耐冻性机制。本实验对猪精子冷冻损伤机制进行深入探讨,分别采用精子质膜脂质组分析、精子/精浆代谢组学分析方法,探索猪精子耐冻性机制并寻找与耐冻性相关的生物标志物,希望能为提高猪精液冷冻效率提供科学的理论依据和新的思路。在本实验的研究中,对目前常见的大白、长白猪精液进行分析,根据复苏后精子质量,最终筛选出高、低耐冻性精液各10份。通过对解冻后的精子进行常规的质量分析,发现相比于鲜精,复苏后的精子运动能力、线粒体活性、质膜完整性显著下降,ROS（reactive oxygen species）水平显著上升。同时,相比于高耐冻性精子,低耐冻性组的精子中,具有更高水平的ROS,同时质膜完整性显著下降。通过代谢组学方法分析差异耐冻性精子中的代谢产物种类与含量,共鉴定出442种代谢产物,经OPLS-DA建模与显著性分析,最终确定在高、低耐冻性精子间油酸、2,4-二硝基甲苯、4-羟基-6-甲基吡喃-2-酮、橙皮油素、乙酰亚精胺、油酰胺等6种代谢产物含量存在显著差异,经KEGG注释分析发现,这些代谢产物主要参与脂肪酸生物合成,结合现有研究,认为油酸可与质膜中的脂质相互作用,调节质膜的流动性与通透性,同时又可作为能量底物调节精子运动能力,由此推断,这些代谢产物会直接或间接的影响着精子的耐冻性,其中质膜可能扮演着重要角色。本实验基于超高效液相色谱与四极杆飞行时间质谱联用技术,并结合脂质组学分析方法,对鲜精、高、低耐冻性精子质膜成分进行分析。经质谱数据采集,共鉴定精子质膜中脂质共计225种,试验结果表明,相比于鲜精,冷冻后的精子质膜组分中胆固醇、磷脂酰胆碱、血溶磷脂酰胆碱和血溶磷脂酰乙醇胺含量大幅上升,鞘磷脂含量降低,复苏后精子质膜中甘油磷脂含量占比由77.6%上升至91.2%,其中磷脂酰胆碱含量占比例由52.35%上升至74.21%,鞘脂类组分（包括神经酰胺、鞘磷脂）含量占比例由20.9%下降至3.7%,经冷冻后的精子质膜成分更趋向与单一化,由此推断,冷冻过程导致精子质膜成分单一可能是影响复苏后精子质量的一个潜在因素。此外,通过对比高、低耐冻性精子质膜组分,共鉴定出15种脂质的含量在差异耐冻性精子间呈现显著差异,包括二氢神经酰胺（18:0/18:0）、4种己糖基神经酰胺（18:1/20:1,18:0/22:1,18:1/16:0,18:1/18:0）、乳糖基神经酰胺（18:1/16:0）、2种血溶磷脂酰乙醇胺（18:2,20:2）、5种磷脂酰胆碱（16:1/18:2,18:2/16:1,14:0/20:4,16:0/18:3,18:1/20:2）、2种磷脂酰乙醇胺（14:0/20:4,18:1/18:3）,其中除具有相似脂肪酸结构（14:0/20:4）的磷脂酰胆碱（PC）以及磷脂酰乙醇胺（PE）在低耐冻性组中含量较高外,其余脂质含量均与耐冻性成正相关。随后,为进一步判断精子质膜的结构与耐冻性的关系,本实验分别采用扫描电镜、透射电镜等技术从精子头部、中段、主段观察对其质膜进行形态学观察,分析结果表明,相比于鲜精,冷冻后的精子质膜出现异常的比例更高,且高耐冻性精子各段质膜情况均优于低耐冻性精子,其中低耐冻性精子的头部、主末段的质膜破损更为严重。综合代谢组分析、脂质组分析与电镜观察可以推测,差异耐冻性精子间代谢水平的差异很有可能通过影响质膜的成分与理化性质,进而影响了精子的耐冻性。除精子代谢水平外,精浆成分对于精子的耐冻性同样具有重要影响。精浆是一种主要来源于睾丸、附睾和副性腺分泌的混合物,其成分一方面能够反应出个体的生理状态,另一方面作为精子的外部环境参与着精子的物质运输,会影响精子的质量以及耐冻性。本实验从精浆代谢产物着手,利用代谢组学筛选高、低耐冻性精液间精浆成分的差异。经超高液相色谱与质谱联用技术,本实验在精浆中共鉴定到953种代谢产物,通过OPLS-DA建模筛选,最终确定50种代谢产物在高、低耐冻性组间的含量存在差异,这些候选生物标志物多参与丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸等氨基酸生物合成代谢通路,由此暗示,个体氨基酸代谢水平可能会影响精子的耐冻性。为进一步确认并筛选精浆中耐冻性生物标志物,本实验利用靶向代谢组学,挑选12种与氨基酸代谢相关的候选生物标志物进行验证,最终确定D-天门冬氨酸、N-乙酰-L-谷氨酸盐、肌苷等3种代谢产物含量在高、低耐冻性组间呈显著差异,其在精浆中的含量均与耐冻性成负相关。本研究通过精子的常规质量检测结合代谢组学、脂质组学、电镜技术等分析方法,最终确定在高、低耐冻性精液间,精子中脂质代谢水平、质膜成分以及精浆中与氨基酸代谢相关的部分代谢产物均存在显著差异,本实验首次从代谢水平出发,分析精子代谢、质膜成分与耐冻性的关系,为研究精子耐冻性机制、提高猪精液冷冻保存效率、筛选耐冻性生物标志物提供了新的理论依据和研究思路。